Summary

مناعي لونين من الظهرية جذر الأنسجة العقد التالي من الإصابات محواري

Published: July 20, 2011
doi:

Summary

نقدم طريقة للمناعي لونين من الجذر الظهراني الأنسجة العقد التالي محواري إصابة. ويمكن استخدام النهج لتحديد مواقع محددة ملزمة عامل النسخ والتعديل اللاجينية الهامة هيستون والحمض النووي للتجديد المحاوير بجروح في كل من الجهاز العصبي المحيطي والمركزي.

Abstract

المحاوير في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تجديد في حين أن أولئك في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) لا تتجدد على نطاق محدود بعد الاصابه (تنغ وآخرون ، 2006). فمن المسلم به أن يتم تنشيط البرامج الترانسكربتي ضرورية لنمو وneurite محواري عند الاصابة في الجهاز العصبي المحيطي (Makwana وآخرون ، 2005). إلا أن الأدوات المتاحة لتحليل الخلايا العصبية في الجسم الحي تنظيم الجينات محدودة وصعبة في كثير من الأحيان.

في العقد الجذرية الظهرية (DRG) تقدم نموذجا ممتازا إصابة النظام لأن معصب كلا من الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي من محوار متشعبة مصدره سوما نفسه. والعقد يمثل مجموعة متميزة من الهيئات الخلية حيث تحدث عن الأحداث النسخي ، وبالتالي توفير منطقة محددة بوضوح من النشاط الترانسكربتي التي يمكن بسهولة وإزالته من بتكاثر الحيوانات. وينبغي أن إصابة الألياف العصبية في الجهاز العصبي المحيطي (مثل العصب الوركي) ، حيث تجدد المحاور لم يحدث ، تكشف عن وجود مجموعة من برامج النسخ التي تختلف عن تلك الاستجابة لاصابة مماثلة في الجهاز العصبي المركزي ، حيث التجديد لا يأخذ مكانه (الحبل الشوكي على سبيل المثال ). ويمكن وصف مواقع لعامل النسخ ملزمة ، وتعديل هيستون الحمض النووي الناجم عن إصابة الجهاز العصبي المركزي أو الجهاز العصبي المحيطي إما باستخدام لونين مناعي (رقاقة).

هنا ، نحن تصف بروتوكول الشذرة الثابتة باستخدام الأنسجة DRG الماوس التالية محواري إصابة. هذا المزيج يوفر وسيلة قوية لتحديد خصائص بيئة لونين المؤيدة للتجديد اللازمة لتعزيز تجدد المحاور.

Protocol

1. الوركي واصابة في العمود الظهري العصبية يتم وضع الحيوان على منشفة الجراحية وتحت عليه thermopad موجود في جميع أنحاء الإجراء الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الماوس عند 37 درجة مئوية. جميع الحيوانات هي تخدير للجراحة مع إدارة ?…

Discussion

هذا البروتوكول يوفر طريقة مباشرة لنسأل عن البيئة خلال لونين محواري التجديد في الجهاز العصبي الكبار التالية محواري إصابة. اشتماله على نموذج إصابة DRG مع مناعي لونين للتحقيق في بيئة النسخي وجينية لاحقة للاصابة إما إلى الجهاز العصبي المحيطي أو الجهاز العصبي المركزي. ان?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر اندريا تيديشي للمساعدة في تحديد التجارب الأولية الشذرة في المختبر ويندنر ريكو لمساهمته في تهذيب شروط الشذرة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة Hertie ؛ المنحة فورتشن ، جامعة توبنغن ، ومنح دي DFG 1497/1-1 (منح جميع لسيمون دي جيوفاني).

Materials

Reagent Company Catalogue number
10x ChIP Buffer Cell Signaling 7008
2x ChIP Elution Buffer Cell Signaling 7009
ChIP Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling 9006
Magna Grip Rack (8 well) Millipore 20-400
Chloroform MERCK UN 1888
37% Formaldehyde ROTH CP10.1
10x Glycine Solution Cell Signaling 7005
Glycogen Sigma G1767
10x HBSS Gibco 14185
Histone H3 antibody (rabbit) Cell Signaling 2650
Normal Rabbit IgG Cell Signaling 2729
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol ROTH A156.1
Protease Inhibitors Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Proteinase K (20 mg/ml) Cell Signaling 10012
SDS Lysis Buffer Upstate 20-163
Equipment needed
Sonicator
Micropestle
Microcentrifuge
Thermomixer

References

  1. Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
  2. Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
  3. Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
  4. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
  5. Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
  6. Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
  7. Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
  8. Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
  9. Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).

Play Video

Cite This Article
Floriddia, E., Nguyen, T., Di Giovanni, S. Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury. J. Vis. Exp. (53), e2803, doi:10.3791/2803 (2011).

View Video