Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales
Summary
Nous présentons une méthode pour immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux après une lésion axonale. L'approche peut être utilisée pour identifier des sites spécifiques facteur de transcription liant et la modification épigénétique de l'importance des histones et l'ADN pour la régénération des axones lésés à la fois dans le système nerveux central et périphérique.
Abstract
Axones dans le système nerveux central (SNC) ne se régénèrent pas, tandis que ceux du système nerveux périphérique (SNP) ne régénère dans une certaine mesure après une blessure (Teng et al., 2006). Il est reconnu que les programmes de transcription essentiels à la croissance des neurites et axonales sont réactivés lors d'une lésion au niveau du SNP (Makwana et al., 2005). Toutefois, les outils disponibles pour analyser la régulation des gènes in vivo des neurones sont limitées et souvent difficiles.
Les ganglions de la racine dorsale (DRG) offrent un système de blessures, car les deux excellents modèle de SNC et du SNP sont innervés par un axone bifurqué provenant du soma mêmes. Les ganglions représentent une collection discrète de corps cellulaires où tous les événements transcriptionnels se produire, et fournir ainsi une région clairement définie de l'activité transcriptionnelle qui peuvent être facilement et de façon reproductible retiré de l'animal. Blessure de fibres nerveuses au niveau du SNP (nerf sciatique par exemple), où la régénération axonale ne se produisent, devraient révéler un ensemble de programmes transcriptionnels qui sont distincts de ceux répondant à une blessure similaire dans le SNC, où la régénération n'a pas lieu (par exemple, la moelle épinière ). Sites pour le facteur de transcription liant, histones et modification de l'ADN résultant d'une blessure à l'autre SNP ou SNC peuvent être caractérisés en utilisant immunoprécipitation de la chromatine (ChIP).
Ici, nous décrivons un protocole puce en utilisant les tissus fixés DRG la souris après une lésion axonale. Cette puissante combinaison fournit un moyen pour caractériser l'environnement chromatine pro-régénération nécessaire pour favoriser la régénération axonale.
Protocol
Discussion
Ce protocole fournit une méthode pour poser directement sur l'environnement chromatine lors de la régénération axonale dans le système nerveux adulte après une lésion axonale. Il intègre le modèle de blessures avec des DRG immunoprécipitation de la chromatine à sonder l'environnement et épigénétiques de la transcription à la suite de blessures ni à la SNP ou SNC. Il est particulièrement utile pour les enquêteurs qui voudraient caractériser les sites putatifs de liaison pour le facteur de trans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Andrea Tedeschi pour les aider à mettre les expériences de ChIP initiales en laboratoire et Ricco Lindner pour sa contribution à affiner les conditions de ChIP. Ce travail a été soutenu par la Fondation Hertie, la subvention de Fortune, Université de Tübingen, et la DFG DI subventions 1497/1-1 (tous accordés à Simone Di Giovanni).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
