Summary

Kromatin Aksonal Yaralanma Dorsal Kök Ganglia Doku Immunoprecipitation

Published: July 20, 2011
doi:

Summary

Biz dorsal kök ganglion dokusundan kromatin immunoprecipitation aksonal yaralanma sonrası için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşım, belirli bir transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri ve periferik ve santral sinir sistemi hem de yaralı aksonların rejenerasyonu için histon ve DNA önemli epigenetik modifikasyon tanımlamak için kullanılır.

Abstract

Periferik sinir sistemi (PNS), bu yaralanma sonrası sınırlı bir ölçüde (Teng ve ark, 2006), rejenerasyon yaparken, merkezi sinir sistemi (MSS) aksonlar rejenere yok . PNS (Makwana ve ark, 2005) yaralanması üzerine yeniden neurite ve aksonal akıbet transkripsiyonel programları için gerekli olduğu kabul edilmektedir. Ancak, in vivo nöronal gen regülasyonu analiz araçları sınırlı ve genellikle zorlu .

Dorsal kök gangliyon (DRG), santral sinir sistemi ve PNS hem de aynı soma kaynaklanan bir çatallı akson tarafından innerve çünkü mükemmel bir yaralanma model sistem sunmaktadır. Ganglionlar tüm transkripsiyonel olaylar meydana hücre gövdeleri ayrı bir toplama temsil eder ve bu nedenle kolay ve tekrarlanabilir hayvan çıkarılabilir transkripsiyonel aktivitesini açıkça tanımlanmış bir bölge. Aksonal rejenerasyon meydana PNS (örneğin siyatik sinir), sinir lifleri Sakatlık rejenerasyon yerde (örneğin omurilik almaz MSS benzer bir yaralanma yanıt, farklı bir dizi transkripsiyonel programları ortaya .) Histon, bağlayıcı transkripsiyon faktörü ve yaralanma ya PNS veya MSS çıkan DNA modifikasyonu Siteleri kromatin immunoprecipitation (ChIP) ile karakterize edilebilir.

Burada, aksonal yaralanma sonrasında sabit fare DRG doku kullanarak ChIP protokol açıklar. Bu güçlü kombinasyon, aksonal rejenerasyonu teşvik için gerekli yanlısı rejenerasyon kromatin ortamı tanımlamak için bir araç sağlar.

Protocol

1. Siyatik ve dorsal kolon sinir hasarı Hayvan cerrahi bir havlu üzerine yerleştirilir ve bunun altında bir thermopad farenin vücut ısısı 37 ° tutmak ° C işlem boyunca mevcut. Bütün hayvanlar, sürekli bir izofluran O / 2 yönetim ameliyat için anestezi . Cerrahi aletler, işlem öncesi otoklavlanırlar. Siyatik yaralanma, hem kıç dikkatle traş, epilasyon, Betadyne 3 kez izledi alkol ile cilt temizliği için önce genel saç çıkarıcı ile tamamlandı. Siyati…

Discussion

Bu protokol doğrudan aksonal yaralanma aşağıdaki yetişkin sinir sisteminde aksonal rejenerasyon sırasında kromatin çevre ile ilgili sormak için bir yöntem sağlar. PNS veya merkezi sinir sistemi ya da yaralanma sonraki transkripsiyonel ve epigenetik bir ortam probu ile kromatin immunoprecipitation DRG yaralanma modeli içermektedir. Sevdikleri transkripsiyon faktörü bağlayıcı varsayılan siteleri karakterize etmek istiyorum ve bu sitelerin doluluk hasarına yanıt olarak oluşup oluşmadığını belirlem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz ince ayar ChIP için yaptığı katkılardan dolayı laboratuar ve Ricco Lindner ilk ChIP deneyleri Andrea Tedeschi yardım için teşekkür etmek isterim. Bu çalışma, Hertie Vakfı tarafından desteklenen; Fortune Grant, Tübingen Üniversitesi, ve DFG DI 1497/1-1 hibe (tüm Simone Di Giovanni verilen).

Materials

Reagent Company Catalogue number
10x ChIP Buffer Cell Signaling 7008
2x ChIP Elution Buffer Cell Signaling 7009
ChIP Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling 9006
Magna Grip Rack (8 well) Millipore 20-400
Chloroform MERCK UN 1888
37% Formaldehyde ROTH CP10.1
10x Glycine Solution Cell Signaling 7005
Glycogen Sigma G1767
10x HBSS Gibco 14185
Histone H3 antibody (rabbit) Cell Signaling 2650
Normal Rabbit IgG Cell Signaling 2729
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol ROTH A156.1
Protease Inhibitors Cocktail Tablets Roche 04 693 116 001
Proteinase K (20 mg/ml) Cell Signaling 10012
SDS Lysis Buffer Upstate 20-163
Equipment needed
Sonicator
Micropestle
Microcentrifuge
Thermomixer

References

  1. Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
  2. Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
  3. Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
  4. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
  5. Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
  6. Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
  7. Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
  8. Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
  9. Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).

Play Video

Cite This Article
Floriddia, E., Nguyen, T., Di Giovanni, S. Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury. J. Vis. Exp. (53), e2803, doi:10.3791/2803 (2011).

View Video