Summary
كان يعمل الإلكترون ممغطس صدى (EPR) التحليل الطيفي للكشف عن اكسيد النيتريك من الخلايا البطانية الأورطي البقري وأنيون دسموتاز الراديكالية من العدلات الإنسان باستخدام الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا)
Abstract
النتروجين التفاعلي / أنواع الاكسجين (ريوس / RNS) بتركيزات منخفضة تلعب دورا هاما في تنظيم وظيفة الخلية، مما يشير، واستجابة جهاز المناعة ولكن في تركيزات غير المنظم تضر بقاء الخلية 1 و 2. في حين أن الأنظمة الحية تطورت مع الداخلية وآليات الدفاع المضادة للأكسدة الغذائية لتنظيم روس جيل، ويتم إنتاج ريوس مستمر وكأنها أمر طبيعي والمنتجات من عملية التمثيل الغذائي العادي للأوكسجين ويمكن أن يسبب الضرر التأكسدي للالجزيئات الحيوية مما يؤدي إلى فقدان وظيفة البروتين وانقسام الحمض النووي، أو دهن بيروكسيد 3، و في نهاية المطاف إلى الاكسدة مما أدى إلى إصابة أو موت الخلية 4.
أنيون دسموتاز الراديكالية (O 2 • -) هو مقدمة كبيرة لبعض من أكثر الأنواع المؤكسدة للغاية تعرف أنها موجودة في النظم البيولوجية مثل peroxynitrite والهيدروكسيل. جيل من O 2 • - يشير إلى أول بادرة من انفجار الأكسدة، وبالتالي، أناTS كشف و / أو عزل في النظم البيولوجية هو المهم. في هذه المظاهرة، O 2 • - قد ولدت من العدلات النوى (PMNs). من خلال تحفيز الكيميائي مع phorbol-12-myristate-خلات-13 (PMA)، PMN يولد O 2 • - عن طريق تفعيل أوكسيديز نيكوتيناميد ثنائي النوكليوتيد الأدينين (NADPH) فوسفات 5.
أكسيد النيتريك (NO) سينسيز والتي تأتي في ثلاثة الأشكال الإسوية، ومحرض، العصبية، وNOS البطانية، أو iNOS، nNOS أو أنوش، على التوالي، ويحفز على تحويل أرجينين-L إلى L-سيترولين، وذلك باستخدام لإنتاج NADPH رقم 6 . هنا، ولدت لدينا أي من الخلايا البطانية. في ظل ظروف الاكسدة، يمكن أنوش على سبيل المثال التحول من إنتاج NO إلى O 2 • - في عملية تسمى uncoupling، التي يعتقد أن سببها أكسدة الهيم (7) أو المشارك عامل، tetrahydrobiopterin (BH 4) 8.
هناك عدد قليل فقطوتقتصر وسائل موثوق بها للكشف عن الجذور الحرة في النظم البيولوجية ولكن عن طريق خصوصية وحساسية. ويشيع استخدام تعويض اللون تدور لتحديد الجذور الحرة وينطوي على رد فعل جذري إضافة إلى فخ تدور تشكيل معقد إضافي تدور الثابتة، ويمكن الكشف عنها بواسطة التحليل الطيفي الإلكترون ممغطس (EPR) صدى. وadducts مختلف جذري معرض طيف المميزة والتي يمكن استخدامها لتحديد الجذور التي يتم توليدها ويمكن أن توفر ثروة من المعلومات عن طبيعة وحركية الإنتاج جذري 9.
وقد تم في nitrones دوري، 5،5، ثنائي ميثيل-بيرولين-N-أكسيد، DMPO 10، DEPMPO فسفوريل-استبدال 11، واستر، بديلا، EMPO 12 و BMPO 13، استخدمت على نطاق واسع الشراك تدور - تدور الأخير الفخاخ واظهار أطول فترة منتصف العمر لO 2 • - معقد إضافي. الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا) 2 </ يستخدم عادة> الباطن إلى اعتراض NO نظرا لارتفاع معدل تكوين معقد إضافي واستقرار عالية للناتج إضافة زيادة ونقصان 14.
Protocol
1. ثقافة خلايا الشريان الأورطي البقري غشائي (BAEC)
- وتم اتباع تقنيات التعقيم المناسبة.
- في وسط المياه، وحمام دافئ بدون المضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: المتوسط ويتكون من الفينول المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر الحر (DMEM) مع 4،5 غ / ل D-جلوكوز، 4 مم L-الجلوتامين، 1٪ غير الاساسيين من الأحماض الأمينية، على أن تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 2.5 ملغم / لتر عامل نمو بطانة.
- إزالة الخلايا التي تحتوي على قارورة T75 من الحاضنة وتنظيف سطح القارورة مع الايثانول 70٪ قبل وضعه داخل غطاء محرك السيارة.
- إزالة متوسط العمر باستخدام الشافطة وتغسل مرتين مع 5 مل من Dulbecco للفوسفات المالحة العازلة (DPBS).
- أضف 2 مل من التربسين والانتظار لمدة 4-5 دقيقة للخلايا لفصل اثناء تفقده دوريا تحت المجهر.
- أضف 3 مل من المتوسط وخلط مرارا باستخدام ماصة للر منفصلةانه الخلايا وخلق تعليق حتى.
- نقل 5 مل من المتوسط مع التربسين إلى أنبوب 15 مل و الطرد المركزي في 121 غ لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف باستخدام الشافطة. أضف 5 مل من DPBS وتخلط جيدا. الطرد المركزي في 121g لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف وإعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق إضافة 6 مل من المتوسط.
- على طبق من 6 أيضا، إضافة 1 مل من تعليق إلى خلية كل جيدا ثم يضاف 1 مل من المتوسط. مزيج وقف استخدام ماصة.
- تسمية لوحة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
2A. الكشف عن خلية لا مع BAEC
- وتم اتباع تقنيات التعقيم المناسبة.
- إزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة ونضح وسيلة من البئر الأولى. غسل الخلايا مرتين مع DPBS 1 مل.
- إضافة ميكرولتر 210 من 1.9 ملي مول كبريتات الحديد heptahydrate (II) (4 FeSO 0.7 H 2 O، وإعداد حديثا عن طريق إذابة 0.8 ملليغرام في1 DPBS مل مع CaCl 2 و MgCl 2) وميكرولتر 210 من الأمونيوم ن ميثيل مد glucamine dithiocarbamate (مليون جالون يوميا، وإعداد حديثا عن طريق إذابة 2،7 ملغ في 500 DPBS ميكرولتر مع CaCl 2 و MgCl 2) باستخدام نسبة من 1:07 (ملاحظة: تم عرض هذه النسبة حيث يتم استخدام فائض مليون جالون يوميا يعملون تقليديا في إعداد الحديد 2 +-MGD مجمع يرجع ذلك إلى حقيقة أن العائد على الحديد 3 + إلى أقصى حد ممكن، مليون جالون يوميا في وجود فائض مليون جالون يوميا وإضافة أسكوربات في حل لتحقيق الاستقرار في الحديد 2 +-مليون جالون يوميا وليس من الضروري منذ 3 NO-FE يتم خفض التطور الطبيعي +-MGD شكلت لكشف EPR NO-FE-2 + مليون جالون يوميا من قبل أسكوربات، هيدروكينون، أو السيستين مع كفاءة تحويل تصل إلى 99.9٪ .. وتدور diamagnetic منخفض دولة من الحديد 2 + يسمح للكشف عن 15 باستخدام خلية شقة أو الأنابيب الشعرية من دون الحاجة إلى جهاز درجة حرارة منخفضة) NO.
- دوامة مما أدى إلى تعليق جيد وإضافة 4،6 μلتر من ionophore الكالسيوم (كاي) (أعدت من حل سهم من 1.9 ملي مول عن طريق إذابة 1 ملغ في DMSO مل 1).
- دوامة الحل مرة أخرى، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة من أجل السماح للمزيد من الحد من الحديد-NO-3 + مليون جالون يوميا للكشف EPR NO-FE-2 + مليون جالون يوميا.
- جمع وطاف (425 ميكرولتر) في أنبوب إيبندورف ونقل إلى زنزانة EPR شقة (أو إلى أنبوب شعري 50 ميكرولتر).
- المعلمات اكتساب EPR هي: الميكروويف تردد: 9.8 غيغاهرتز، وسط الميدان: 3427 G؛ تعديل السعة: 6.0 G، عرض اكتساح: 100 غرام، كسب المتلقي: 1 × 10 5؛ الميكروويف الطاقة: 10 ميغاواط، العدد الكلي للفحوصات: 121؛ وقت الاجتياح: 10 ثانية، ومرة ثابت: 20 مللي ثانية (ملاحظة: منذ المعلمات تختلف من صك واحد والظروف التجريبية إلى آخر، لذلك، فقط وسط الميدان والتردد والسعة التشكيل هي أهم المعايير للنظر فيها.).
- تسجيل الأطياف في درجة حرارة الغرفة والأطياف 2-D وintegتصنيف للحد من الضوضاء في الخلفية والأساس تصحيح باستخدام بروكر معالجة البيانات WinEPR البرامج أو غيرها من برامج معالجة البيانات. لالكمي لتشكيل معقد إضافي، ويمكن بناؤها المؤامرات مستوى شدة تركيز مقابل إشارة (أو منطقة) باستخدام SNAP المانحة NO.
2B. أنوش Uncoupling التجربة
- إزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة ونضح وسيلة من البئر الثانية، وتغسل مرتين مع DPBS 1 مل.
- واستخدمت الجهات المانحة peroxynitrite، 5-الأمينية-3-(4-morpholinyl) -1،2،3-oxadiazolium كلوريد (SIN-1) إلى فك الارتباط بين أنوش 16. أضف 100 ميكرولتر من 0.5 مم SIN-1 (M ص ز / مول، في الفترة من 10 ملي حل الأوراق المالية الطازجة عن طريق إذابة 1 ملغ SIN-1 في 500 ميكروليتر من PBS مع عدم وجود أيونات الكالسيوم / المغنيسيوم 206.6) DPBS والمخففة إلى 2 مل مع و 10٪ FBS.
- احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- إزالة لوحة من الحاضنة وتغسل مرتين مع DPBS.
- إضافة ميكرولتر 210 منمليون جالون يوميا 2.8 مم FeSO 4 0.7 H 2 O وميكرولتر 210 من 19.6 ملي الطازجة وفقا للإجراءات المذكورة أعلاه.
- دوامة الحل وإضافة 4.6 ميكرولتر من تساى ملي 1.9.
- دوامة الحل مرة أخرى، واحتضان على 37 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة.
- جمع وطاف (425 ميكرولتر) في أنبوب إيبندورف ونقلها إلى خلية شقة EPR.
- المعلمات اكتساب EPR هي: الميكروويف تردد: 9.8 غيغاهرتز، وسط الميدان: 3427 G؛ تعديل السعة: 6 G؛ عرض اكتساح: 100 غرام، كسب المتلقي: 1 × 10 5؛ الميكروويف الطاقة: 10 ميغاواط، العدد الكلي للفحوصات: 121؛ وقت الاجتياح: ق (10)؛ والوقت ثابت: MS 20.
- تسجيل الأطياف وأدمجت أطياف 2-D للحد من الضوضاء في الخلفية والأساس تصحيحها على النحو المذكور أعلاه.
3. الكشف عن O 2 • - من العدلات الأشكال النوى (PMNs)
- تم عزل العدلات من عينة دم الإنسان كما هو موضح سابقا 17.
- جعل حل سهم DMPO M 1 * في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ملي diethylenetriamine-pentaacetic حامض (DTPA). DMPO لديه درجة انصهار 25-29 درجة مئوية لذلك هو أكثر ملاءمة لماصة DMPO السائلة (كثافة ~ 1.02 غرام / مل عند 25 درجة مئوية) في لقارورة زجاجية (ملاحظة: لا تستخدم القنينات البلاستيكية لوزنها منذ DMPO نقي يتفاعل مع البلاستيك). ويمكن ذاب المجمدة DMPO عن طريق تشغيل الماء الدافئ إلى قارورة (ملاحظة: لا تقم بتشغيل الماء الساخن كما DMPO قد تتحلل).
- من المهم لاستخدام عالية النقاء DMPO (> 99٪) منذ بعض الفخاخ تدور متوفرة تجاريا تحتوي على شوائب متوازي المغنطيسية، وبالتالي، فمن الضروري لتشغيل طيف EPR من حل عادل DMPO وحدها (10 ملم في هذه الحالة). فمن الأهمية بمكان أن عدم وجود إشارة الخلفية هو واضح (انظر الشكل 3A).
- يعد حل الأوراق المالية (1 ملغ / مل) من phorbol-12-myristate-خلات-13 (PMA) في DMSO. جعل aliquots بواسطة تمييع الحل إلى 10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني.
- في (أ) 1.5 أنبوب إيبندورف مل، يعد حل بإجمالي قدره 0.6 مل من خلال اتباع تسلسل إضافة: ~ 10 6 خلية لكل مليلتر من PMN، D-جلوكوز (1 ملغ / مل)، والزلال (1 ملغ / مل)، 10 ملي DMPO و 0.2 ميكروغرام / مل من سلطة النقد الفلسطينية. (ملاحظة: سلطة النقد الفلسطينية هو المنشط جذرية وينبغي أن يضاف الماضي).
- نقل الحل لخلية شقة EPR.
- EPR اكتساب المعلمات الشروط هي: تردد الموجات الدقيقة: 9.8 غيغاهرتز، وسط الميدان: 3486 G؛ تعديل السعة: 0.5 G، عرض اكتساح: 100 غرام، كسب المتلقي: 5 × 10 5، العدد الكلي للمسح: 10؛ وقت الاجتياح: 30 ثانية ؛ طاقة الميكروويف: ميغاواط 20؛ والوقت ثابت: MS 81. لالكمي لتشكيل معقد إضافي، ويمكن بناؤها المؤامرات مستوى شدة تركيز مقابل إشارة (أو منطقة) باستخدام nitroxides مستقر مثل سرعة الإيقاع أو 3-الكربوكسيلية حامض PROXYL.
* ملاحظة هامة بشأن استخدام DMPO: باستخدام خلية شقة، يمكن للمرء أن يزيد من كثافة الخلايا وبالتالي زيادة إشارةكثافة ناتج إضافة تدور ولكن نصف عمر O 2 • - معقد إضافي من DMPO قصيرة (ر 1/2 ~ 1 دقيقة) الذي يتحلل إلى DMPO-OH. يمكن أن تكون بديلا DMPO باستخدام تركيزات نفسه من EMPO، BMPO أو DEPMPO وهي متوافرة تجاريا لاستقرار معقد إضافي مع زيادة ر 1/2 ~ 8 و 14 دقيقة، على التوالي.
4. ممثل النتائج
تم تنفيذ تدور محاصرة من NO جذري باستخدام الحديد 2 +-مليون جالون يوميا. الشكل 2A و 2B لا تظهر أي إشارة EPR من الحديد 2 +-MGD أو خليط من الحديد 2 + مليون جالون يوميا، مع تساى، مشيرا إلى أن عدم وجود إشارة خلفية لا تنبع من هذه الكواشف. BAEC على التحفيز مع تساى النشرات التي لا تتفاعل مع الحديد 2 + مليون جالون يوميا، لتشكل معقد إضافي زيادة ونقصان، NO-FE-2 + مليون جالون يوميا، ويظهر إشارة ثلاثية مميزة مع فائق الدقة تقسيم قيمة (hfsc) ثابت لمجموعة N = 12.66 و مجموعة من العوامل من ز = 2.040. (الشكل 2C). وHFوتم تحديد قيمة SC باستخدام برنامج محاكاة WINSIM التي يمكن تحميلها من برامج معهد علوم الصحة البيئية EPR موقع قاعدة البيانات. وhfsc التجريبية ينسجم مع قيمة الأدب لمجموعة N = 12.70 و ز = 2.041 18 NO الحديد 2 +-MGD معقد إضافي. وبالمثل، خفض تأثير 1-إثم BAEC إنتاج NO نظرا لاينوس uncoupling كما هو مبين في الشكل 2D.
وقد استخدم DMPO تدور فخ لO 2 • - كشف. لم DMPO وحدها لا تعطي إشارة كما هو موضح في الشكل 3A مؤكدا أن فخ تدور خالية من الشوائب متوازي المغنطيسية. الشكل 3B هو طيف من DMPO وPMNs فقط، وعلى نحو مماثل، لا يوجد أي إشارة للكشف مما يدل على أن لا يسبب DMPO تفعيل NADPH أوكسيديز الانزيم. الشكل 3C يظهر إشارة المرصودة EPR على تحفيز PMN من قبل سلطة النقد الفلسطينية. تم تحديد القيم hfsc لهذا إشارة إلى أن يكون N = 14.71 G، A &بيتا؛-H = 11،40 G وγ-H = G 1.25، وتتماشى مع قيم الأدب لمجموعة N = 14.3، وهو β-H = 11،7 G وγ H-= 1.3 G (19) لDMPO-O 2 H معقد إضافي.
الشكل 1. الرسم البياني للكشف عن الجذور من العدلات وBAEC باستخدام EPR محاصرة زيادة ونقصان. وكانت (أ) PMNs مختلطة مع DMPO وسلطة النقد الفلسطينية، والخليط الناتج نقلها إلى خلية شقة EPR للحصول على البيانات. (ب) ونمت BAEC على طبق من ذهب، وغسلها مع DPBS. أضيف تدور الحديد فخ (مليون جالون يوميا) 2 جنبا إلى جنب مع كاي. كانت مختلطة حل شامل والمحتضنة. تم نقل هذا الخليط إلى خلية شقة EPR للحصول على البيانات EPR.
الكشف عن شخصية EPR 2. من NO من Bلجنة الطاقة الذرية. (أ) من الطيف الحديد 2 +-مليون جالون يوميا فقط (B) الطيف من الحديد 2 + +-MGD تساى فقط. (C) طيف توأم ثلاثة نتيجة عدم وجود احتباس بواسطة الحديد 2 +-مليون جالون يوميا باستخدام تساى، حفز الخلايا. (D) الطيف تظهر انخفاضا في أي إنتاج بسبب 0.5 مم SIN-1 علاج الخلايا.
الكشف عن شخصية EPR 3. من H 2 DMPO-O من العدلات تفعيلها. (أ) من الطيف DMPO 10 ملم فقط. (ب) من الطيف PMN وحدها في ظل وجود DMPO 10 ملم. (ج) من الطيف PMN تفعيلها من خلال سلطة النقد الفلسطينية في ظل وجود DMPO 10 ملم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واستخدمت EPR محاصرة تدور في مجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية لقياس وتحديد الجذور الحرة. محاصرة تدور حساس جدا، وقادرة على الكشف عن الجذور بتركيزات تتراوح بين نانومتر إلى ميكرومتر مما يجعلها مناسبة للتطبيق في النظم البيولوجية. تشكيل معقد إضافي متوازي المغنطيسية، NO-FE-2 + مليون جالون يوميا، هو اساس عدم الكشف عن طريق الجيش الشعبي الثوري. FE-2 + مليون جالون يوميا يتفاعل بسرعة مع 18 NO بمعدل ~ 10 6 م -1 ث -1. NO-FE-2 + مليون جالون يوميا معقد إضافي منذ فترة طويلة نصف العمر، وغير مستقر للغاية. في الواقع، يمكن للمرء الحصول على أطياف EPR في غضون 24 ساعة بعد أن تم جمع عينات من خلال تجميد الحلول في -80 درجة مئوية تحتوي على 2 NO-FE +-مليون جالون يوميا من دون خسارة كبيرة في كثافة إشارة (نتائج غير منشورة). العيب من الحديد 2 +-MGD هو أنه الجوية الحساسة وعادة ما يتطلب خلط 5 أو أكثر من مكافئات ضرس من يجند للالحديد (II). أكسدة الحديد 2 + مليون جالون يوميا، إلى الحديد 3 + مليون جالون يوميا، عن طريق الجو أمر لا مفر منه، ويصعب السيطرة عليها، ومع ذلك، في في المختبر، ونظم في الجسم الحي، يتم تقليل NO-FE-3 + مليون جالون يوميا ناتج إضافة شكلتها الاختزال البيولوجي للEPR ويمكن حذف معقد إضافي للكشف NO-FE-2 + مليون جالون يوميا 15، وبالتالي الحاجة إلى إضافة أسكوربات.
ويمكن أيضا EPR أن تستخدم لكشف O 2 • - في النظم البيولوجية باستخدام الفخاخ تدور nitrone. كمثال على ذلك، ويبين الشكل 3C محاصرة تدور باستخدام DMPO من O 2 • - ولدت من سلطة النقد الفلسطينية التي تنشط PMN. واحد سيئات استخدام DMPO كما تدور فخ هو أن نسبة O 2 • -/HO 2 • بالإضافة إلى DMPO بطيئة للغاية (<1 م -1 S -1) في الأس الهيدروجيني المحايدة التي تتطلب استخدام تركيزات عالية من DMPO ( 10-100 ملم) لتطبيقات البيولوجية محاصرة زيادة ونقصان. وعلاوة على ذلك، DMPO-O 1/2 H 2 الحياة قصيرة (<1 دقيقة) 20 </ سوب> التي تتحلل إلى DMPO-OH بسبب وجود الهيدروجين β، ويفتقر إلى الدقة الهدف مما يجعل تحديد موقع الإنتاج جذري من الخلية غامضة. النجاح في O 2 • - كشف يعتمد على نوع من الخلايا المستخدمة. على سبيل المثال، العدلات الإنسان يولد على تحفيز تدفق كبير من O 2 • - لا يمكن الكشف عنها بسهولة باستخدام التي DMPO لكن ينبغي الحذر عند التعامل مع أنواع أخرى من الخلايا حيث الإنتاج جذري هو أقل بكثير قوية (على سبيل المثال، الخلايا البطانية أو طلائي). وقد وضعت nitrones عدة لزيادة عمر النصف للمن O 2 • - ناتج إضافة مثل استخدام EMPO وBMPO مع أنصاف عمر تتراوح بين 7-8 دقائق 12 و 13، والذي يعطي DEPMPO أطول نصف حياة 14 دقيقة 21. ومع ذلك، فإن معدلات زيادة ونقصان محاصرة مع O 2 • - من هذه الفخاخ لا تزال تدور ببطء مقارنة DMPO، وبالتالي لا يزال يحتاج إلى استخدام تركيزات عاليةنشوئها من الفخاخ زيادة ونقصان. استخدام عشوائيا كما تم ميثليته-β-cyclodextrin (ME-β-CD) وذلك كاشف المشترك يعمل من أجل تعزيز القدرة تدور محاصرة من nitrones لO 2 • -. على سبيل المثال استخدام غشاء thylakoid معزولة والجسيمات الضوئي الثاني، وأظهرت Snyrychova 22 أعلى كثافة إشارة والاستقرار ناتج إضافة لH 2 EMPO-O في وجود البيانات-CD-β مقارنة EMPO وحدها. فمن المستحسن لمقارنة الكثافات إشارة ولدت من H 2 nitrone-O في وجود وعدم وجود البيانات-CD-β. وعلاوة على ذلك، فقد كان لخصوصية الهدف من الفخاخ تدور أيضا وجود قيود. الجهود المبذولة لتطوير مصائد تدور أكثر المحسنة التي تتناول التفاعل السيئة إلى O 2 • -، ناتج إضافة قصيرة العمر النصفي والنوعية المستهدفة في تصميم واحد الجزيئية وتجري الآن 23-26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة القومي للقلب والرئة والدم المعهد منحة RO1 HL81248.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P.
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
