Summary
Электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спектроскопии был использован для обнаружения окиси азота из бычьей аорты эндотелиальных клеток и супероксид-анион-радикал из нейтрофилов человека использовании железа (II)-N-метил-D-глюкамин дитиокарбаматных, Fe (МГД)
Protocol
1. Культура говядине аорты эндотелиальных клеток (КАЭБ)
- Правильное асептики были соблюдены.
- В ванну с водой, теплой среде без антибиотиков при температуре 37 ° C.
Примечание: среда состоит из фенола среде без Дульбеко изменения Орла (DMEM) с 4,5 г / л D-глюкозы, 4 мМ L-глутамина, 1%, без незаменимых аминокислот, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 2.5 мг / л, фактор роста эндотелия.
- Удалить T75 колбы, содержащие клетки из инкубатора и очистки поверхности колбы с 70% этанола, прежде чем поместить его внутрь капота.
- Удалите старый среде с помощью аспиратора и мыть два раза с 5 мл фосфатного буфера Дульбеко физиологического раствора (DPBS).
- Добавить 2 мл трипсина и ждать в течение 4-5 мин для клеток оторваться, периодически осмотра под микроскопом.
- Добавьте 3 мл среды и повторно перемешать с помощью пипетки в отдельные тОн клеток и создать еще подвески.
- Передача 5 мл среды с трипсином до 15 мл и трубы центрифуги в 121 г в течение 5 мин.
- Удаляют супернатант использованием аспиратора. Добавить 5 мл DPBS и тщательно перемешать. Центрифуга при 121g в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать осадок клеток, добавляя 6 мл среды.
- На 6-и плиты, добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку добавьте 1 мл среды. Смешать подвески с помощью пипетки.
- Этикетка пластины и инкубировать в течение ночи при 37 ° С и 5% CO 2.
2А. Обнаружение NO с сотового КАЭБ
- Правильное асептики были соблюдены.
- Удалите 6-луночного планшета из инкубатора и аспирации среды от первой скважины. Промойте клетки в два раза с 1 DPBS мл.
- Добавить 210 мкл 1,9 мм железа (II) сульфат гептагидрат (FeSO 4 · 7H 2 O, готовить свежий, растворяя 0,8 мг в1 мл DPBS с CaCl 2 и MgCl 2) и 210 мкл аммония N-метил-D-глюкамин дитиокарбаматных (МГД, готовить свежий, растворяя 2,7 мг в 500 мкл DPBS с CaCl 2 и MgCl 2), используя соотношение 1:7 . (Примечание:. Это соотношение, где избыток МГД используется была обычно используются для подготовки Fe 2 +-комплекса МГД в связи с тем, что выход на Fe 3 + МГД максимальна в присутствии избытка МГД добавлением аскорбиновой кислоты в растворах для стабилизации Fe 2 +-МГД не нужно, так как NO-Fe 3 + МГД формируется эндогенно сводится к ЭПР обнаружено NO-Fe 2 +-МГД по аскорбиновая кислота, гидрохинон, или цистеина с эффективностью преобразования до до 99,9% .. низкое состояние диамагнитных спина Fe 2 + позволяет обнаруживать NO с использованием плоских клеток или капиллярной трубке без необходимости низкой температуры устройства) 15.
- Swirl Полученную суспензию хорошо и добавить 4,6 μл кальция ионофором (CAI) (получают из маточного раствора 1,9 мм путем растворения 1 мг в 1 мл ДМСО).
- Swirl решение снова и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 36 мин, с тем чтобы в дальнейшем позволит снижение NO-Fe 3 + в МГД ЭПР обнаружено NO-Fe 2 +-МГД.
- Соберите супернатант (425 мл) в пробирку Эппендорфа и передачи ЭПР плоских ячейки (или 50 мкл капиллярной трубке).
- Параметры ЭПР приобретения являются: СВЧ: 9,8 ГГц; центре поля: 3427 G; амплитудной модуляции: 6,0 G, развертки ширина: 100 G, усиление приемника: 1 х 10 5, микроволновая мощность: 10 мВт; общего числа сканирований: 121; Время развертки: 10 сек, а постоянная времени: 20 мс (Примечание: Поскольку параметры будут варьироваться в зависимости от инструмента и условий эксперимента к другому, следовательно, только в центре поля, частота и амплитуда модуляции являются наиболее важными параметрами для рассмотрения.).
- Запись спектров при комнатной температуре и 2-D спектры целострассчитаны на снижение шума и базовых исправить с помощью Bruker WinEPR данных программное обеспечение обработки или другой обработки данных, программного обеспечения. Для количественной оценки аддуктов, стандартные участки концентрации по сравнению с интенсивностью сигнала (или площадь) можно построить с помощью NO-доноры SNAP.
2B. Енос разобщение эксперимент
- Удалите 6-луночного планшета из инкубатора и аспирации среды от второй скважины и мыть два раза с 1 DPBS мл.
- Пероксинитрита доноров, 5-амино-3-(4-морфолинил) -1,2,3-oxadiazolium хлорид (SIN-1) был использован для отделить Енос 16. Добавить 100 мкл 0,5 мМ SIN-1 (М т 206,6 г / моль, от 10 мм маточный раствор свежеприготовленный растворением 1 мг SIN-1 в 500 мкл PBS, не Ca / Mg ионов) и разбавленной до 2 мл DPBS и 10% FBS.
- Выдержите в течение 2 ч при 37 ° С и 5% CO 2.
- Снимите пластины из инкубатора и мыть дважды DPBS.
- Добавить 210 мкл2,8 мм FeSO 4 · 7H 2 O и 210 мкл 19.6 мм МГД свежеприготовленный в соответствии с процедурой, упомянутых выше.
- Swirl решение и добавить 4,6 мкл 1,9 мМ CaI.
- Swirl решение снова и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 36 мин.
- Соберите супернатант (425 мл) в пробирку Эппендорфа и передачи ЭПР плоских клеток.
- Параметры ЭПР приобретения являются: СВЧ: 9,8 ГГц; центре поля: 3427 G; амплитудной модуляции: 6 G; развертки ширина: 100 G, усиление приемника: 1 х 10 5, микроволновая мощность: 10 мВт; общего числа сканирований: 121; Время развертки: 10 сек, а постоянная времени: 20 мс.
- Запись спектров и 2-D спектры были объединены для уменьшения фонового шума и базовых исправлены как уже говорилось выше.
3. Обнаружение O 2 • - из полиморфноядерных нейтрофилов (PMNs)
- Нейтрофилы выделяли из образца крови человека, как описано выше 17.
- Сделать маточного раствора 1 М DMPO * в PBS, содержащем 0,1 мМ диэтилентриамин-pentaacetic кислоты (DTPA). DMPO имеет температуру плавления 25-29 ° С, так удобнее, чтобы жидкость пипеткой DMPO (плотность ~ 1,02 г / мл при 25 ° С) в стеклянном флаконе (Примечание: не использовать пластиковые флаконы для взвешивания с чистой DMPO вступает в реакцию с пластмассой). Замороженные DMPO можно расплавить, запустив теплой водой на флаконе (Примечание: не запускать горячую воду, как DMPO могут разлагаться).
- Важно использовать высокую чистоту DMPO (> 99%), так как некоторые коммерчески доступные ловушки спина содержат парамагнитные примеси, и, следовательно, необходимо запустить спектр ЭПР только решение DMPO в одиночку (10 мм в данном случае). Очень важно, чтобы не фонового сигнала очевидна (см. рис 3А).
- Подготовка исходного раствора (1 мг / мл) форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) в ДМСО. Сделать аликвоты путем разбавления раствора до 10 мкг / мл в PBS.
- В 1.5 мл Eppendorf трубки, приготовить раствор с общим объемом 0,6 мл, следуя последовательности того: ~ 10 6 клеток на мл ПМН, D-глюкозы (1 мг / мл) и альбумин (1 мг / мл), 10 DMPO мМ и 0,2 мкг / мл РМА. (Примечание: PMA-радикал и активатора должна быть добавлена последней).
- Передача решения ЭПР плоских клеток.
- ЭПР приобретение параметры условий: СВЧ: 9,8 ГГц; центре поля: 3486 G; амплитудной модуляции: 0,5 G, развертки ширина: 100 G, усиление приемника: 5 х 10 5, общее количество сканирований: 10; Время развертки: 30 сек , микроволновая мощность: 20 мВт, а постоянная времени: 81 мс. Для количественной оценки аддуктов, стандартные участки концентрации по сравнению с интенсивностью сигнала (или площадь) можно построить, используя стабильные нитроксильные, таких как темп или 3-карбоновой кислоты PROXYL.
* Важное замечание по использованию DMPO: С помощью плоской ячейке, можно увеличить плотность клеток и тем самым увеличивая сигналИнтенсивность аддукт спина, но период полураспада O 2 • - аддукт DMPO короткая (T 1/2 ~ 1 мин), который разлагается на DMPO-ОН. DMPO можно заменить, используя те же концентрации EMPO, BMPO или DEPMPO которые имеются в продаже для повышения стабильности аддукт с T 1/2 ~ 8 и 14 мин соответственно.
4. Представитель Результаты
Спиновая захвата никаких радикальных проводили с использованием Fe 2 +-МГД. Рисунок 2А и 2В не показывают сигнал ЭПР от Fe 2 +-MGD или смеси Fe 2 +-МГД с Цай, о том, что нет никакого фона сигнал исходит от этих реагентов. КАЭБ при стимуляции CaI выпускает NO, который реагирует с Fe 2 +-МГД, чтобы сформировать спина аддукт, NO-Fe 2 +-МГД, и показывает характерный сигнал триплет с сверхтонким расщеплением постоянной (HFSC) значение N = 12,66 G и г-фактор G = 2,040. (Рис. 2). ВЧSC стоимость была определена с помощью программы WINSIM моделирования, которые можно загрузить с веб-сайта NIEHS ЭПР базы данных программного обеспечения. Экспериментальные HFSC согласуется с литературными значение N = 12,70 G и G = 2,041 18 NO-Fe 2 +-аддукт МГД. Кроме того, эффект SIN-1 на КАЭБ снизил NO производства в связи с Енос расцепления как показано на рисунке 2D.
DMPO спиновой ловушки использовали для O 2 • - обнаружение. DMPO не только дать сигнал, как показано на рисунке 3A, подтверждающие, что спина ловушка свободного от парамагнитных примесей. Рисунок 3B является спектр DMPO и PMNs только, а так же нет обнаруженный сигнал, предполагая, что DMPO не вызывает активация фермента оксидазы NADPH. Рисунок 3C показывает наблюдаемого сигнала ЭПР при стимуляции ПМН на PMA. HFSC значения этого сигнала было установлено, что N = 14,71 G, ибета-,-Н = 11,40 G и γ-H = 1,25 G, и в соответствии с литературой значения N = 14,3 G, β-H = 11,7 г и γ-H = 1,3 G 19 DMPO-O 2 H аддукта.
Рисунок 1. Схема для обнаружения радикалов из нейтрофилов и КАЭБ использованием ЭПР захвата спин. (A) PMNs были смешаны с DMPO и PMA, и полученную смесь передается ЭПР плоских ячейки для сбора данных. (B) КАЭБ выращивали на пластине, и промывают DPBS. Спиновой ловушки Fe (МГД) 2 была добавлена вместе с Кай. Раствор тщательно перемешивают и инкубируют. Смесь была передана ЭПР плоских ячейки для приобретения данных ЭПР.
Рисунок 2. ЭПР обнаружения NO с BAEC. (A) спектр Fe 2 +-МГД только (B) спектр Fe 2 + + МГД CaI только. (C) Триплет спектр результате NO захватом Fe 2 +-МГД использованием CaI стимулированных клеток. (D) Спектр показывает снижение производства из-за NO до 0,5 мм SIN-1 обработка клеток.
Рисунок 3. ЭПР обнаружения DMPO-O 2 H от активированных нейтрофилов. (А) Спектр 10 мМ DMPO только. (Б) Спектр ПМН только в присутствии 10 мМ DMPO. (C) Спектр ПМН активируется PMA в присутствии 10 мМ DMPO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ЭПР спин захват был использован в широком диапазоне биомедицинских приложений для количественной оценки и выявления свободных радикалов. Спин захвата обладает высокой чувствительностью, способны обнаруживать радикалы в концентрациях от нМ до мкМ что делает его пригодным для применения в биологических системах. Образование парамагнитных аддукт, NO-Fe 2 +-МГД, является основой не может определить с помощью ЭПР. Fe 2 +-МГД реагирует с NO быстрее 18 со скоростью ~ 10 6 М -1 с -1. NO-Fe 2 +-аддукт МГД имеет длительный период полувыведения и очень стабильный. На самом деле, можно приобрести спектрах ЭПР в течение 24 часов после того, как образцы были собраны путем замораживания растворов при -80 ° С, содержащих NO-Fe 2 +-МГД без существенных теряют в интенсивности сигнала (неопубликованные результаты). Недостатком Fe 2 +-МГД является то, что воздух чувствительны и обычно требует смешивания 5 или более молярных эквивалентов лигандаFe (II). Окисление Fe 2 +-МГД в Fe 3 + МГД по воздуху неизбежны и трудно контролировать, однако, в пробирке и в естественных системах, NO-Fe 3 + МГД аддукт формируется снижается биологическая восстановителей в ЭПР обнаружить аддукт NO-Fe 2 +-МГД 15, следовательно, необходимость аскорбиновой кислоты дополнительно может быть опущен.
ЭПР может быть использован для обнаружения O 2 • - в биологических системах, использующих нитронной ловушки спина. В качестве примера, на рисунке 3C показывает спину захватом использованием DMPO О 2 • - полученные от PMA-активированных нейтрофилов. Одним из недостатков использования DMPO как спин ловушка в том, что скорость O 2 • 2 • -/HO дополнение к DMPO очень медленно (<1 М -1 с -1) при нейтральном рН, который требует использования высоких концентраций DMPO ( 10-100 мм) для биологических применений захвата спин. Кроме того, DMPO-O 2 H полувыведения составляет короткий (<1 мин) 20 </ Sup>, которое распадается на DMPO-OH в связи с наличием β-водородом, и не имеет целевую специфику принятия определения места радикалов из клетки неоднозначна. Успех в O 2 • - обнаружение зависит от типа клеток используется. Например, нейтрофилов человека при стимуляции создает значительный поток O 2 • - которые могут быть легко обнаружены с помощью DMPO но предостережение должно быть сделано при работе с другими типами клеток, где радикалов значительно менее надежные (например, эндотелиальных и эпителиальных клеток). Несколько нитронов были разработаны с целью увеличения периода полураспада О 2 • - аддукт, такие как использование EMPO и BMPO с периодом полураспада 12 мин 7-8, 13 и DEPMPO который дает длинный период полураспада 14 мин 21. Тем не менее, темпы спина захвата с O 2 • - эти спиновые ловушки остаются медленными по сравнению с DMPO, и поэтому по-прежнему требует использования высоких концентрацияхспина ловушки. Использование случайно метилированных-β-циклодекстрина (Me-β-ЦД) в качестве со-реагент был также использован для повышения спину захватом способность нитронов для O 2 • -. Например, использование изолированных тилакоидов мембраны и фотосистемы II частицы, Snyrychova 22 показали высокую интенсивность сигнала и аддукт стабильности EMPO-O 2 H в присутствии Me-β-CD по сравнению с EMPO в одиночку. Настоятельно рекомендуется сравнить интенсивность сигнала генерируется из нитронной-O 2 H в присутствии и отсутствии Me-β-CD. Кроме того, специфика целевой спиновых ловушек также было ограничений. Усилия по разработке более совершенных спиновые ловушки, которые касаются их плохой реактивности к O 2 • -, короткие аддукт полураспада и целевой специфики в одной молекулярный дизайн в настоящее время ведутся 23-26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NIH Национальный институт сердца, легких и крови институт грант RO1 HL81248.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P.
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
