Summary
전자 상자 성체의 공명 (EPR) 분광학은 철 (II)-N-메틸-D-glucamine dithiocarbamate, 철 (MGD)를 사용하여 인간 neutrophils에서 소 대동맥 내피 세포와 초과 산화물 라디칼 음이온에서 질소 산화물을 감지하기 위해 고용되었다
Abstract
낮은 농도에서 반응 질소 / 산소 종 (ROS / RNS)은 신호 전달, 세포 기능 조절에 중요한 역할을하고, 면역 반응하지만, 관계가없는 농도에서 세포 생존 능력 1, 2에 해로운입니다. 살아있는 시스템이 ROS 생성을 조절하는 내생과식이 항산화 방어 메커니즘으로 발전했지만, ROS는 산소의 정상적인 신진 대사의 부산물 자연으로 연속적으로 생산되며 단백질 기능의 손실, DNA의 절단, 또는 지방질의 결과 biomolecules의 산화 손상을 일으킬 수 peroxidation 3, 궁극적으로 세포 부상 또는 사망 4로 이어지는 산화 스트레스합니다.
초과 산화물 라디칼 음이온 (O 2 • -)는 같은 peroxynitrite와 급진 히드록실과 같은 생물 학적 시스템에 존재하는 것으로 알려진 가장 높은 산화 종의 주요 전구체이다. O 2의 생성 • - 그러므로 산화 버스트의 첫 징후 신호를하고, 전TS 감지 및 / 또는 생물 학적 시스템의 격리가 중요합니다. 이 예제에서는 O 2 •이 - polymorphonuclear neutrophils (PMNs)에서 생성되었다. phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA)와 chemotactic 자극을 통해, PMN는 O 2 •를 생성 - 니코틴 아데닌 dinucleotide 인산 (NADPH) 옥시 데이스 5 활성화를 통해.
세 isoforms으로 제공 질소 산화물 (NO) synthase는 inducible -,의 연결 및 내피-NOS, 또는 iNOS, nNOS 나 eNOS는 각각 어떠한 6 생산도하는 NADPH를 이용하여 L-시트룰린로 L-아르기닌의 전환 catalyzes로 . 여기서는 내피 세포에서 아니오를 생성 않습니다. 산화 스트레스 조건 하에서, 예를 들어 eNOS는 O 2 •로 NO 생산으로 전환할 수 - 헴 7 또는 공동 인자, tetrahydrobiopterin (BH 4) 8 산화로 인한 것으로 생각됩니다 uncoupling라는 프로세스에.
오직 몇 가지가있다하지만 생물 학적 시스템의 자유 래디 칼의 검출을위한 안정적인 방법은 특이성과 감도에 의해 제한됩니다. 스핀 트래핑은 일반적으로 자유 래디 칼의 식별에 사용되며 전자 상자 성체의 공명 (EPR) 분광학에 의해 감지 수있는 영구적인 스핀 adduct를 형성 스핀 트랩에 대한 급진의 추가 반응을 포함하고 있습니다. 다양한 급진 부가물가 생성되는 래디 칼을 식별하고 급진적인 생산 9 자연과 속도론에 관한 풍부한 정보를 제공할 수 사용될 수 특유의 스펙트럼을 나타냅니다.
주기적 nitrones, 5,5 - 디메틸-pyrroline-N-옥사이드, DMPO 10 phosphoryl - 치환 DEPMPO 11 및 에스테르 - 치환, EMPO 12 BMPO 13, 널리 스핀 트랩으로 고용되어 - 후자의 스핀 adduct - 함정는 O 2 • 위해 더 이상 반 목숨을 전시. 철 (II)-N-메틸-D-glucamine dithiocarbamate, 철 (MGD) 2 </ 서브>는 일반적으로 adduct 형성과 스핀 adduct 14 높은 안정성의 높은 비율로 어떠한 인해를 잡을수 없다하는 데 사용됩니다.
Protocol
1. 소의 대동맥 내피 세포 (BAEC)의 문화
- 적절한 무균 기법을 미행했다.
- 37 항생제없이 물 목욕, 따뜻한 매체 ° C로
주 : 중간 4.5 G / L D-글루코오스와 페놀 무료 Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM)로 구성되어 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 2.5과 함께 보완 4 MM L-글루타민, 1 %가 아닌 필수 아미노산, MG / L 내피 성장 인자.
- 인큐베이터에서 T75 플라스크 들어있는 세포를 제거하고 후드 안쪽에 그것을 배치하기 전에 70 %의 에탄올과 플라스크의 표면을 청소하십시오.
- 흡인기를 사용하여 기존의 매체를 제거하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 5 ML로 두 번 씻는다.
- 트립신 2 ML을 추가하고 정기적으로 현미경으로 검사하는 동안 분리 전지 4-5 분 기다립니다.
- 매체 3 ML을 추가하고 반복적으로 별도의 t에 피펫을 사용하여 혼합그는 세포도 정지를 만듭니다.
- 5 분 대한 121g에서 약 15 ML 튜브와 원심 분리기에 트립신과 매체의 5 ML을 전송합니다.
- 흡인기를 사용하여 표면에 뜨는을 제거합니다. DPBS 5 ML을 추가하고 철저하게 섞는다. 5 분 동안 121g에서 원심 분리기.
- 뜨는을 대기음 및 매체 6 ML을 추가하여 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
- 6 - 잘 접시에, 그럼 중간 1 ML을 추가할 각 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. 피펫을 사용하여 정지를 섞습니다.
- 접시 라벨과 37 하룻밤 품어 ° C에서 5 % CO 2.
2A. BAEC 전지와 NO의 탐지
- 적절한 무균 기법을 미행했다.
- 배양기에서 6 잘 플레이트를 제거하고 첫 번째 우물에서 매체를 기음. 한 ML의 DPBS으로 두 세포를 씻으십시오.
- 1.9 MM 철 (II) 황산의 heptahydrate (FeSO 4 0.7 H 2 O에서 0.8 밀리그램을 분해하여 신선하게 준비 중 210 μl를 추가하십시오1시 7분의 비율을 사용하여 한 CaCl 2, MgCl 2 ML DPBS)와 암모늄 N-메틸-D-glucamine dithiocarbamate (MGD, CaCl 2, MgCl 2 500 μl DPBS에서 2.7 밀리그램을 분해하여 신선하게 준비)의 210 μl . (참고 :. 초과 MGD가 사용되는이 비율은 통상 철 3에 대한 수율은 + MGD이 초과 MGD의 면전에서 최대있다는 사실로 인해 + MGD 복잡한 철 2의 준비를 위해 고용되었습니다의 추가 철 2를 안정화하기위한 솔루션 아스코 브 산은 + MGD NO-철 3 이래로 형성된 + MGD는 endogenously 아스코 브 산, 히드로퀴논, 또는 최대 변환 효율과 시스테인으로 + MGD이 NO-철 EPR 감지로 줄어 듭니다 필요하지 않습니다 99.9 %로 .. 철 2의 낮은 스핀 diamagnetic 상태 + NO) 저온 장치의 필요없이 평면 셀 또는 모세관을 사용하여 15 검출이 가능합니다.
- 소용돌이 결과 현탁액 잘하고 4.6 μ 추가칼슘 ionophore의 리터 (CAI) (1 ML DMSO에 1 밀리그램을 해소하여 1.9 mm의 주식 솔루션에서 준비).
- 소용돌이 다시 솔루션 및 순서 36 분 대한 ° C에서 추가 - 철 NO 3의 감소는 NO-철 2 +-MGD EPR 감지에 + MGD 수 있도록 37 알을 품다.
- Eppendorf 튜브 및 EPR 평평한 세포 (또는 50 μl 모세관까지) 이전에 뜨는 (425 μl)를 수집합니다.
- EPR 수집 매개 변수는 다음과 같습니다 마이크 로파 주파수 : 9.8 GHz의, 중심 분야 : 3,427 G, 변조 진폭 : 6.0 G, 스위프 폭 : 100 G, 리시버 게인 : 1 × 10 5; 마이크 로파 전력 : 10 MW, 스캔의 총 개수 : 121; 스위프 시간 : 10의, 그리고 시정수 : 20 MS (참고 : 매개 변수가 하나의 악기와 실험 조건에서 다른 달라질 수 있기 때문에, 따라서만을 중심 분야, 주파수 및 변조 진폭은 고려해야 할 가장 중요한 매개 변수입니다.).
- 실온에서 스펙트럼을 기록하며 2 차원 스펙트럼은 integ되었습니다Bruker WinEPR 데이터 처리 소프트웨어 또는 다른 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 수정 배경 소음 기준을 줄이기 위해 평가. adduct 형성 부량 들어, 집중력 대 신호 강도 (또는 지역)의 표준 줄거리는 기증자 스냅인 아니오를 사용하지 구축하실 수 있습니다.
2B. eNOS Uncoupling 실험
- 배양기에서 6 잘 플레이트를 제거하고 두 번째 우물에서 매체를 대기음 1 ML의 DPBS로 두 번 씻는다.
- peroxynitrite 기증자, 5 - 아미노 -3 - (4-morpholinyl) -1,2,3-oxadiazolium 염화물 (SIN-1)은 eNOS 16 개를 풀다하는 데 사용되었다. 0.5 밀리미터 SIN-1 (M R 206.6 갓 노 CA / MG 이온과 PBS 500 μl에 1 MG SIN-1을 해소하여 준비 10 밀리미터 주식 솔루션에서 G / 몰) 및 묽은 ~ 2 ML과 DPBS 100 μl를 추가하십시오 와 10 % FBS.
- 37 2 시인데 동안 품어 ° C에서 5 % CO 2.
- 인큐베이터에서 접시를 제거하고 DPBS로 두 번 씻는다.
- 의 210 μl 추가2.8 MM FeSO 4 0.7 H 2 O와 19.6 mm의 210 μl와 신선한 위에서 언급한 절차에 따라 준비 MGD.
- 소용돌이 솔루션 및 1.9 밀리미터 CAI의 4.6 μl를 추가합니다.
- 소용돌이 다시 솔루션 및 36 분 동안 37 ° C에서 품어.
- Eppendorf 튜브 및 EPR 평평한 감방으로 전송에서 (425 μl) 뜨는 수집합니다.
- EPR 획득 파라미터는 다음과 같습니다 마이크로 웨이브 주파수 : 9.8 GHz의, 중심 분야 : 3,427 G, 변조 진폭 : 6 G, 스위프 폭 : 100 G, 리시버 게인 : 1 × 10 5; 마이크 로파 전력 : MW 10, 스캔의 총 개수 : 121; 스위프 시간 : 10의, 그리고 지속 시간 : 20 MS.
- 스펙트럼을 기록하며 2 차원 스펙트럼은 위에서 언급한 수정 배경 소음 기준을 줄이기 위해 통합되었다.
3. O 2의 탐지 • - Polymorphonuclear Neutrophils에서 (PMNs)
- 이전 17 설명된대로 Neutrophils은 인간의 혈액 샘플에서 고립되었다.
- diethylenetriamine-pentaacetic 아세트산 (DTPA) 0.1 밀리미터를 포함하는 PBS에 1 M DMPO *의 주식 솔루션을 확인하십시오. DMPO는 25-29의 융점을 가지고 ° C ~ 그것이 유리관 (주에 액체 DMPO을 (고밀도 ~ 1.02 G / ML 25 ° C) 피펫 것이 더 편리하므로 : 순수 DMPO 이후 무게를 위해 플라스틱 튜브를 사용하지 않습니다 ) 플라스틱과 반응. 냉동 DMPO는 유리병 (DMPO가 분해 수 있으므로 온수를 실행하지 않는 주)에 루크의 온수를 실행하여 녹아 수 있습니다.
- 그것은 이후 고순도 DMPO를 (> 99 %)를 사용하는 것이 중요 상용 스핀 트랩 중 일부는 상자 성체의 불순물을 포함하고, 따라서 그것만으로도 DMPO 솔루션의 EPR 스펙트럼 (이 경우 10 MM)를 실행하는 것이 필수적입니다. 그것은 배경 신호 (그림 3A 참조) 분명없는 것이 중요합니다.
- DMSO의 phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA)의 주식 솔루션 (1 밀리그램 / ML) 준비합니다. 10 μg / PBS의 ML에 대한 솔루션을 diluting하여 aliquots하십시오.
- 1.5 ML Eppendorf 튜브는 또한 순서에 따라 0.6 ML의 총 부피와 솔루션을 준비 : PMN의 ML 당 ~ 10 6 세포, D-글루코오스 (1 밀리그램 / ML) 및 알부민 (1 밀리그램 / ML), 10 MM DMPO와 PMA의 0.2 μg / ML. (참고 : PMA는 급진 활성제이며, 마지막으로 추가됩니다.)
- EPR 편평한 세포에 대한 솔루션을 전송합니다.
- EPR 인수 매개 변수 조건은 다음과 같습니다 마이크로 웨이브 주파수 : 9.8 GHz의, 중심 분야 : 3,486 G, 변조 진폭 : 0.5 G, 스위프 폭 : 100 G, 리시버 게인 : 5 × 10 5; 스캔의 총 개수 : 10, 스위프 시간 : 30의 ; 마이크 로파 전력 : 20 MW, 그리고 지속 시간 : 81 MS. adduct 형성 부량 들어, 집중력 대 신호 강도 (또는 지역)의 표준 줄거리는 같은 템포 또는 3 - 카르복실산-PROXYL 등 안정 nitroxides를 사용하여 건설 수 있습니다.
DMPO의 사용에 대한 * 중요 참고 : 평면 세포를 사용함으로써, 하나는 세포 밀도를 높이고이를 통해 신호를 증가 수스핀 adduct지만, O 2의 반감기의 강도 • - DMPO의 adduct가 DMPO-OH로 분해하는 (T 2분의 1 ~ 1 분) 짧습니다. DMPO는 t 2분의 1 ~ 8, 각각 14 분, 함께 증가 adduct의 안정성을 위해 상업적으로 사용할 수 있습니다 EMPO, BMPO 또는 DEPMPO의 동일한 농도를 사용하여 대체 할 수 있습니다.
4. 대표 결과
스핀 NO 라디칼의 포집이 철 2 +-MGD. 그림 2A와 2B를 사용하여 수행되었다 철 2에서 더 EPR 신호를 보여주지 + MGD 또는 철 2의 혼합 아무런 배경 신호 어떠한 이러한 시약 유래 없다는 것을 나타내는 CAI와 + MGD.에게 CAI와 자극시 BAEC는 철 2 반응하는 아니오를 출시하지 스핀 adduct, NO-철 2 +-MGD을 형성 + MGD, 그리고 초미세 분리 상수 (hfsc) N = 12.66 G의 가치와 특성 삼인승 신호를 보여줍니다 g = 2.040의 G-요소. (그림 2C). HFSC 값이 NIEHS EPR 소프트웨어 데이터베이스 웹 사이트에서 다운로드할 수 있습니다 WINSIM 시뮬레이션 프로그램을 사용하여 결정되었다. 실험 hfsc은 NO-철 2 +-MGD adduct를위한 N = 12.70 G와 g = 2.041 18 문학의 가치와 일치합니다. 마찬가지로, BAEC에 SIN-1의 효과는 그림 2D와 같이 uncoupling eNOS에 의해 생산 아니오를 낮춘 없습니다.
감지 - DMPO 스핀 트랩이 O 2 • 위해 사용되었다. 스핀 트랩은 상자 성체의 불순물에서 무료임을 확인하는 그림 3A와 같이 혼자 DMPO은 신호를주지 않았다. 그림 3B는 DMPO의 스펙트럼과 PMNs에만, 그리고 마찬가지로, DMPO이 발생하지 않는다는 것을 제안 전혀 감지 신호가 없습니다 효소 NADPH 산화 효소의 활성화. 그림 3C는 PMA에 의한 PMN의 자극시 관찰된 EPR 신호를 보여줍니다. 이 신호에 대한 hfsc 값은 N = 14.71 G, & 것으로 확인되었습니다베타,-H = 11.40 G 및 γ-H = 1.25 G, 그리고 N = 14.3 G, β-H = 11.7 G 및 γ-H의 문헌 값 DMPO-O 용 = 1.3 G 19 일치 2 시인데의 adduct.
그림 1. EPR 스핀 트래핑을 사용하여 neutrophils과 BAEC에서 래디 칼의 검출을위한 플로우 차트. () PMNs는 DMPO와 PMA 섞인 있었고, 결과 혼합물은 데이터 수집을위한 EPR 평평한 세포로 전학 왔어. (B) BAEC는 접시에 성장하고, DPBS로 씻어되었습니다. 스핀 트랩 철 (MGD는) 2 CAI와 함께 추가되었습니다. 솔루션은 철저하게 혼합하고 incubated되었다. 혼합물은 EPR 데이터 수집을위한 EPR 평평한 세포로 이송되었다.
B에서 NO의 그림 2. EPR 검출AEC. 철 2 (A) 스펙트럼 + MGD 전용 (B) + MGD + CAI 전용 철 2의 스펙트럼. (C) 철 2로 NO 트래핑으로 인한 삼인승 스펙트럼이 + MGD 사용하여 세포를 CAI 것은 자극. (D)으로 인해 0.5 MM 세포의 SIN-1 처리에 어떠한 생산의 감소를 보여주는 스펙트럼.
활성화 neutrophils에서 DMPO, O 2 H의 그림 3. EPR 검출. 10 밀리미터 DMPO 전용의 () 스펙트럼. (B) 10 밀리미터 DMPO의 앞에서 혼자 PMN의 스펙트럼. (C) PMN의 스펙트럼은 10 밀리미터 DMPO의 면전에서 PMA에 의해 활성화.
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Discussion
EPR의 스핀 트래핑은 자유 래디 칼을 quantifying 및 식별을 위해 생명 의학 애플 리케이션의 광범위한 채용되었습니다. 스핀 트래핑은 고도로 민감한 NM에서 따라서 생물 학적 시스템의 응용에 적합하게 μm의에 이르기까지 다양한 농도로 래디 칼을 감지 할 수있다. 상자 성체의의 adduct, NO-철 2 +-MGD의 형성은 EPR 통해 NO 검출의 기초입니다. ~의 속도로 10 6 M -1 s의 -1에서 NO 빠르게 18과 철 2 + MGD 반응을 보이고있어. NO-철 2 +-MGD adduct는 긴 반감기를 가지고 있으며, 매우 안정이다. 샘플은 -80에서 솔루션을 오해에서 수집한 후에 실제로 한 24 시간 이내에 EPR 스펙트럼을 수집할 수 ° C + MGD 상당한는 신호 강도 (미발표 결과)에 손실없이 NO-철 2를 포함하는. 철 2의 단점은 + MGD 그것이 공기를 구분한다는하며 일반적으로 리간드의 5 이상을 어금니에 상응하는 믹싱이 필요합니다철 (II). 철 2의 산화는 공기 + MGD 철 3 + MGD 것은 통제할 불가피하고 어렵습니다 그러나 시험 관내 및 생체내 시스템의에서 NO-철 3 형성된 + MGD adduct은 EPR에 생물 학적 reductants에 의해 감소됩니다 따라서 감지 adduct NO-철 2 +-MGD 15, 아스코 브 산 추가에 대한 필요성은 생략할 수 있습니다.
nitrone 스핀 트랩을 사용하여 생물 학적 시스템의 - EPR은 또한 O 2 •를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 3C는 O 2 • 중 DMPO를 사용하여 스핀 트래핑를 보여줍니다 - PMA-활성 PMN에서 생성된. 스핀 트랩으로 DMPO을 사용하는 중 하나 단점입니다 O 2의 비율 • -/HO 2 • DMPO 외에이 (DMPO의 높은 농도를 사용해야 중성 산도에서 (<1 M -1들 -1) 매우 느리게 생물 학적 스핀 트래핑 응용 프로그램을위한 10-100 ㎜). 또한, DMPO-O 2 H 반쯤 생활 (<1 분) 20 짧습니다 </ 저녁을 먹다> β-수소의 존재로 인해 DMPO-OH로 분해하고, 모호한 세포에서 급진적인 생산의 사이트의 결정 만들기 대상 특이성이 부족 있습니다. O 2 •에서의 성공 - 감지가 사용되는 세포의 종류에 따라 다릅니다. 예를 들어, 자극시 인간 neutrophils는 O 2의 상당한 자속을 생성 • - 어느가 쉽게 DMPO를 사용하여 감지가 가능하지만, 세포의 다른 유형을 상대할 때는 급진적인 생산이 훨씬 적은 강력한 (예 : 내피 또는 상피 세포) 어디에주의를하여야한다. 여러 nitrones는 O 2의 반감기를 높이기 위해 개발되었습니다 • - 예 7-8의 절반 - 삶의 긴 반감기를 제공 분 12, 13, 그리고 DEPMPO과 EMPO 및 BMPO의 사용 등 adduct 14 분 21. 그러나, O 2 • 함께 포집 스핀의 속도 - 이러한 스핀 트랩은 살아 DMPO에 비해 느리고 유지, 따라서 여전히 높은 집중의 사용을 필요로스핀 트랩의 기. 무작위 공동 시약 등 methylated-β-사이클로 덱스트린 (ME-β-CD가)도 O 2 nitrones의 스핀 트래핑 능력을 향상시키기 위해 고용되었습니다의 사용 • -. 격리된 thylakoid 막과 photosystem II 입자를 사용하여 예를 들어, Snyrychova 22 홀로 EMPO에 비해 ME-β-CD의 존재에 EMPO, O 2 H 높은 신호 강도와 adduct의 안정성을 보여주었다. 그것은 강력하게 ME-β-CD의 존재와 부재에 nitrone, O 2 H에서 생성된 신호 강도를 비교하는 것이 좋습니다. 또한, 스핀 트랩의 대상 특이성도 제한되었습니다. O 2 ~ 그들의 가난한 반응을 해결보다 향상된 스핀 트랩을 개발하기 위해 노력 • - 짧은 adduct 반감기 한 분자 설계의 타겟 특이성은 이제 23-26 진행되고 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 국립 심장 폐 및 혈액 연구소 부여 RO1 HL81248에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
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