Summary
采用电子顺磁共振（EPR）光谱检测牛主动脉内皮细胞和人类使用铁（II）-N-甲基-D葡萄糖胺二硫代氨基甲酸铁（百万加仑）中性粒细胞超氧阴离子自由基一氧化氮
Abstract
活性氮/氧（ROS / RNS的）在低浓度时发挥了重要作用，在调节细胞功能的信号，以及免疫反应，但不稳定的浓度是有害的细胞活力1，2。虽然生活系统演变与内源性和膳食抗氧化防御机制来调节活性氧的产生，活性氧产生自然正常的氧代谢的产品不断，并可能导致氧化损伤生物大分子蛋白质功能丧失，DNA断裂，或脂质过氧化反应，并最终以氧化应激导致细胞损伤或死亡4。
超氧阴离子自由基（O2• - ）是主要易制毒化学一些如过氧亚硝基阴离子和羟自由基的生物系统中存在已知的最高度氧化的物种。一代的O 2• -标志着氧化爆发的第一个迹象，因此，我TS检测和/或封存在生物系统是重要的。在这个演示中，O 2的 • -中性粒细胞（中性粒细胞）的产生。通过与佛-12-肉豆蔻-13-醋酸酯（PMA）的趋化刺激，中性粒细胞产生O 2的 • -通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶5。
一氧化氮（NO）合酶三种亚型，作为诱导，神经元和内皮一氧化氮合酶，或iNOS，nNOS或eNOS的，分别催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸，用NADPH的产生NO 6 。在这里，我们从血管内皮细胞NO生成。 eNOS的，例如可以在氧化应激条件下，不产生切换到O 2• -在一个名为解偶联过程中，这被认为是造成氧化血红素7或共同因素，呤（波黑）8。
有只有少数自由基在生物系统中检测的可靠方法，但仅限于由特异性和敏感性。常用的自旋捕获自由基的鉴定，并涉及到自旋陷阱，形成一个持久的自旋加合物，可通过电子顺磁共振（EPR）光谱检测自由基的加成反应。各种激进的加合物，表现出鲜明的频谱可以用来确定所产生的自由基，并能提供丰富的信息的性质和动力学激进生产9。
循环硝，5,5 -二甲基吡咯氮氧化物，DMPO 10，磷取代DEPMPO 11，酯取代，EMPO 12和13 BMPO，已广泛采用自旋陷阱-后者的自旋陷阱参展较长的半衰期为O 2• -加合物。铁（II）-N-甲基D-葡萄糖胺二硫代氨基甲酸铁（百万加仑）2 </ SUB>常用捕获没有因加合物的形成和稳定性高自旋加合物14率高。
Protocol
1。培养的牛主动脉内皮细胞（BAEC）
- 适当的无菌技术。
- 在水洗澡，温暖的介质无抗生素在37°C。
注：中等苯酚免费Dulbecco的改良鹰的介质，4.5 g / L的Ð-葡萄糖（DMEM培养基），4毫米L-谷氨酰胺，1％非必需氨基酸氨基酸，辅以10％胎牛血清（FBS），和2.5 mg / L的内皮细胞生长因子。
- 从孵化器的T75瓶中含有细胞和前罩内放置清洁瓶表面用70％乙醇。
- 删除旧的介质，使用吸气和用5毫升杜尔贝科的磷酸盐缓冲液（DPBS）的两倍。
- 加入2毫升的胰蛋白酶，等待4-5分钟为细胞分离，同时定期在显微镜下检查。
- 加入3毫升的介质和反复混合使用吸管分开ţ他细胞，并创建一个甚至暂停。
- 转让5毫升培养基，胰蛋白酶15毫升管和离心5分钟在121Ğ。
- 使用抽吸去除上清。加入5毫升的DPBS调匀。在121克离心5分钟。
- 吸上清液，再加入6毫升培养基暂停细胞沉淀。
- 在6孔板，每个加1毫升细胞悬液，然后加入1毫升的媒介。混合暂停使用吸管。
- 标示板孵育过夜37°C和5％CO 2。
2A。 BAEC细胞细胞没有检测
- 适当的无菌技术。
- 从孵化器的6孔板和抽吸介质，从第一口井。洗细胞两次用1毫升DPBS。
- 加入210微升1.9毫米铁（II）硫酸亚铁（硫酸亚铁4 .7 H 2 O，准备由溶解在0.8毫克新鲜CaCl 2和MgCl 2的 1毫升DPBS）和铵的N-甲基-D-葡萄糖胺二硫代氨基甲酸（MGD的，刚准备CaCl 2和MgCl 2的 2.7毫克，溶解于500μLDPBS）210μL，使用比例为1:7 （注：这多余的MGD的使用比例已编制的Fe 2 + MGD的复杂，由于对Fe 3 +-MGD的产量存在过剩MGD的最大化为传统雇用增补抗坏血酸溶液中稳定的Fe 2 + MGD的是没有必要的，因为铁的NO-3 + MGD的形成是内生减少的EPR检测无铁抗坏血酸，对苯二酚，或半胱氨酸与转换效率高达2 + MGD 99.9％..低自旋铁2抗磁状态+允许检测NO的低温设备的需求不使用扁平细胞或毛细管）15。
- 涡流产生的悬浮增加4.6μ钙离子载体（蔡升）（从1.9毫米的储备溶液溶解在1 mL二甲基亚砜1毫克）。
- 漩涡的解决方案和孵化，在37°C为36分钟，以进一步减少NO的铁3 + MGD的EPR检测NO铁2 + MGD的。
- 收集上清（425μL）在一个Eppendorf管中，并转移到EPR扁平细胞（或50μl的毛细管）。
- EPR的收购参数：微波频率：9.8 GHz的中心领域：3427 G，调制幅度：6.0克;扫描宽度：100克;接收增益：1×10 5;微波功率：10毫瓦;扫描总数：121;扫描时间：10秒;时间常数：20毫秒（注：由于参数会有所不同，从一台仪器和实验条件，因此，仅在中心场，频率和调制幅度要考虑的最重要的参数。）。
- 记录在室温下的光谱和二维光谱INTEG额定降低背景噪声和基线校正使用布鲁克WinEPR数据处理软件或其他数据处理软件。量化加合物的形成，浓度与信号强度（或地区）的标准地块可以建造使用NO供体SNAP。
2B。 eNOS的解耦实验
- 从孵化器的6孔板和吸第二口井从中期和1毫升DPBS洗两次。
- 一个的过氧捐助，5 -氨基-3 - （4 -吗啉）-1,2,3 oxadiazolium的氯化物（单-1）是用来解耦eNOS的16。加入100μL0.5毫米单-1（M R206.6克/摩尔，从10毫米原液刚准备在500 PBS液无钙/镁离子溶解1毫克仲1）稀释至2毫升DPBS和10％FBS的。
- 孵育2小时37°C和5％的CO 2。
- 从孵化器中取出板和用DPBS两次。
- 加入210μL2.8毫米硫酸亚铁4 .7 H 2 O和210微升19.6毫米MGD新鲜准备根据上述的程序。
- 漩涡的解决方案，并加入4.6微升1.9毫米蔡。
- 漩涡的解决方案，并在37°C孵育36分钟。
- 在一个Eppendorf管中，并转移到一个EPR的扁平细胞收集上清（425μL）。
- EPR的采集参数为：微波频率：9.8 GHz的中心领域：3427Ğ;调制幅度：地下6;扫描宽度：100克;接收增益：1×10 5;微波功率：10毫瓦;扫描总数：121;扫描时间：10秒，时间常数：20毫秒。
- 记录的光谱进行了整合，以减少背景噪声和基线纠正上述的2-D光谱。
3。 -中性粒细胞（中性粒细胞检测的O 2）
- 如先前所述17中性粒细胞从人体血液样本分离。
- 使股票的1米DMPO *在PBS溶液中二乙烯三胺五乙酸（DTPA）的0.1毫米。 DMPO具有熔点25-29°C间，所以它是更方便吸取液体DMPO（密度〜1.02克/毫升在25°C）在一个玻璃小瓶（注：不使用塑料瓶称重自纯DMPO与塑料发生反应）。冷冻DMPO可以融化运行温水小瓶（注：不运行热水DMPO可以分解）。
- 重要的是，使用高的DMPO纯度（> 99％）以来的一些市售自旋陷阱包含顺磁杂质，因此，当务之急是只是DMPO解决方案单独运行的EPR谱（在这种情况下，10毫米）。这是至关重要的，没有任何背景信号是明显的（ 见图3A）。
- 准备股票佛-12-肉豆蔻-13-醋酸酯（PMA），在DMSO溶液（1毫克/毫升）。稀释至10微克/毫升的PBS溶液等分。
- 在1。5毫升的Eppendorf管，准备一个解决方案，除了序列与总体积为0.6毫升〜10 6个细胞，中性粒细胞每毫升，D-葡萄糖（1毫克/毫升）和白蛋白（1毫克/毫升），10毫米DMPO和PMA的0.2微克/毫升（注：PMA的是激进的激活和应补充的最后）。
- 转让EPR的扁平细胞的解决方案。
- EPR的采集参数的条件是：微波频率：9.8 GHz的中心场：3486 G，调制幅度：0.5克;扫描宽度：100克;接收增益：5×10 5;扫描总数：10;扫描时间：30秒微波功率为20兆瓦;时间常数：81毫秒量化加合物的形成，使用，如速度或3羧酸PROXYL的，稳定的氮氧自由基浓度与信号强度（或地区）的标准地块可以建造。
*的DMPO使用的重要注意事项：通过扁平细胞，可以增加细胞密度，从而增加信号自旋加合物，但O 2的半衰期强度- DMPO加合物短（T 1/2〜1分钟）分解DMPO-OH。 DMPO可以使用相同浓度的EMPO，BMPO或DEPMPO的可供加合物的稳定增加，商业与T 1/2〜8和14分钟，分别取代。
4。代表结果
NO的自由基的自旋捕获使用铁2 + MGD的。 图2A和2B显示没有EPR信号由Fe 2 + MGD的或+ MGD蔡，表明这些试剂没有背景信号源于铁的混合物。后与蔡刺激的BAEC细胞释放NO的反应与Fe 2 + MGD形成的自旋加合物，铁2 + MGD的，显示了超精细分裂常数（HFSC）N = 12.66Ğ价值和特点的三重信号G = 2.040 g因子。 （ 图2C）。在HFSC值确定使用的WINSIM的模拟程序，可以从NIEHS的EPR软件数据库网站下载。实验HFSC 一个 N = 12.70 G和G = 2.041 18 NO铁2 + MGD的加合物的文学价值是一致的。同样，单仲偕-1的BAEC细胞的作用，降低NO的生产由于eNOS的解偶联图2D所示。
为O 2• -检测DMPO自旋陷阱。 DMPO单没有发出信号，确认是从顺磁杂质的自旋陷阱图3A所示图3B是DMPO频谱和中性粒细胞，同样，也没有检测到的信号表明，不会导致DMPO NADPH氧化酶的激活。 图3C显示由PMA刺激中性粒细胞后观察到的EPR信号。这个信号的HFSC值被确定为一个 N = 14.71 G，一个与β; - H = 11.40 G 和γ-H = 1.25克，是一个 N = 14.3Ğ，β - H = 11.7克和γ-H的文学价值= 1.3克19 DMPO - O 2Ĥ加合物。
图1。使用EPR的自旋捕获中性粒细胞和BAEC细胞的自由基的检测流程图。 （ 一 ）中性粒细胞与DMPO和PMA混合，和由此产生的混合物转移到一个EPR数据采集的扁平细胞。 （二）BAEC细胞生长盘子上，与DPBS洗涤。与蔡一起加入自旋陷阱铁（百万加仑）2。该解决方案是彻底混合培养。被转移到一个EPR EPR数据采集单位细胞的混合物。
图2。EPR检测从B NO的AEC。 （ 一 ）频谱的Fe 2 + MGD（二）对Fe 2 + MGD的+蔡谱。 （三）三重频谱从没有捕获导致铁2 + MGD的使用蔡刺激细胞。 （四）频谱显示NO产量下降至0.5毫米，SIN-1细胞治疗。
图3。EPR检测DMPO-O 2 H激活中性粒细胞。 （ 一 ）频谱DMPO只有10毫米。 （二）中性粒细胞在10毫米DMPO存在单独的频谱。 （三）由PMA激活中性粒细胞的频谱在10毫米DMPO存在。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在医学领域的应用范围广泛，量化，并确定自由基的EPR自旋捕获已受聘。是高度敏感，能够检测从纳米从而使其适合在生物系统中的应用到μM的浓度自由基的自旋捕获。形成顺加合物，无铁2 + MGD的，是没有通过的EPR检测的基础上。的Fe 2 +-MGD的反应与NO迅速率10 6米-1 S -1的〜18。无铁2 + MGD的加合物，具有半衰期长，高度斯塔比尔。事实上，人们可以在24小时内获得EPR谱后收集样本已被冻结的解决方案在-80°C，含有铁的NO-2 + MGD没有显著失去信号强度（未发表结果）。铁2的缺点+ MGD的是，它是空气敏感，通常需要5个或更多的配体摩尔等值混合铁（II）。铁氧化2 +铁空运+ MGD MGD是不可避免的，难以控制，但是， 在体外和体内系统中，铁的NO-3 +-MGD的加合物形成生物还原剂减少到EPR检测加合物铁2 + MGD的15，因此需要抗坏血酸除了可以省略。
的EPR也可用于检测Ø2• -在生物系统使用硝自旋陷阱。作为一个例子， 图3C显示的O 2•使用DMPO自旋捕获-从PMA激活中性粒细胞产生的。 DMPO自旋陷阱的缺点之一是，O 2的速度-/HO 2•除了DMPO是非常缓慢，这就需要使用的DMPO高浓度的中性pH值（<1米-1 S -1）（ 10-100毫米），用于生物自旋捕获应用。此外，DMPO-O 2 H半衰期很短（<1分钟）20 </ SUP>分解DMPO-OH由于β-氢的存在，缺乏目标的特殊性，使网站从细胞自由基产生歧义的决心。在O 2•成功-检测取决于正在使用的细胞类型。例如，人类中性粒细胞刺激后产生相当通量的O 2 -可以很容易地使用DMPO检测，但应谨慎处理与其他类型的细胞时，激进的生产显着不太可靠（ 例如 ，内皮或上皮细胞）。几个已发展到硝半衰期增加的O 2• -加合物，如使用7-8半衰期为12分钟，13和DEPMPO给出最长的半衰期EMPO和BMPO 14分钟21。然而，与O 2•这些自旋陷阱诱捕-自旋率仍然缓慢相比，以DMPO，因此仍需要使用高浓度TION的自旋陷阱。使用随机甲基-β-环糊精（ME-β-CD），作为共同试剂也已提高自旋捕获的硝能力为O 2 - 。例如，对于使用孤立的类囊体膜和光系统II颗粒，Snyrychova 22 O 2 H EMPO，更高的信号强度和存在的ME-β-环糊精相比EMPO单独加合物的稳定。强烈建议比较硝-O 2 H-β-环糊精的存在和缺乏产生的信号强度。此外，特异性自旋陷阱的目标也受到了限制。努力开发更完善的自旋陷阱，解决他们的贫困反应为O 2 -加合物的短半衰期和目标中的一个分子设计特异性现正进行23-26。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由NIH的国家心脏，肺和血液研究所授予RO1的HL81248。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P.
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
