Summary
Elektron paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi blev anvendt til at detektere nitrogenoxid fra bovine aortiske endotheliale celler og superoxidradikal anion fra humane neutrofiler med jern (II)-N-methyl-D-glucamin dithiocarbamat, Fe (MGD)
Abstract
Reaktive nitrogen / oxygenspecies (ROS / RNS) ved lave koncentrationer spiller en vigtig rolle i reguleringen af celle-funktion, signalering, og immunrespons, men i regulerede koncentrationer er skadelige for cellelevedygtighed 1, 2. Mens levende systemer har udviklet med endogene og diætmæssige antioxidant-forsvarssystemer mekanismer til regulering ROS generation, ROS produceres kontinuerligt som naturligt biprodukter fra normale metabolisme af oxygen og kan forårsage oxidativ beskadigelse biomolekyler resulterer i tab af protein-funktion, DNA-spaltning eller lipid peroxidering 3, og i sidste ende at oxidativt stress, der fører til celleskade eller død 4.
Superoxidradikal anion (O 2 • -) er større precursor for nogle af de mest stærkt oxiderende arter vides at eksistere i biologiske systemer, såsom peroxynitrit og hydroxylradikal. Generering af O2 • - signalerer første tegn på oxidativ burst, og derfor, its påvisning og / eller binding i biologiske systemer er vigtig. I denne demonstration, O2 • - blev genereret fra polymorfnukleære neutrofiler (PMN'er). Gennem kemotaxisk stimulering med phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), genererer PMN O2 • - via aktivering af nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADPH) oxidase 5.
Nitrogenoxid (NO)-synthase, der findes i tre isoformer, som inducerbare-, neuronal-og endothel-NOS, eller iNOS, nNOS eller eNOS henholdsvis katalyserer omdannelsen af L-arginin til L-citrullin, under anvendelse NADPH at producere NO 6 . Her har vi frembragt NO fra endotelceller. Under oxidative stress-tilstande, kan eNOS for eksempel gå fra fremstilling NO til O2 • - en proces, der kaldes frakobling, som menes at være forårsaget af oxidering af hæm 7 eller co-faktoren, tetrahydrobiopterin (BH 4) 8.
Der er kun fåpålidelige metoder til påvisning af frie radikaler i biologiske systemer, men er begrænset af specificitet og følsomhed. Spin trapping er almindeligt anvendt til identifikation af frie radikaler og omfatter additionsreaktion af en radikal med en spin trap danner en vedvarende centrifugering addukt, som kan detekteres ved elektronmikroskopi paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi. De forskellige radikale Addukterne udstille karakteristisk spektrum, som kan bruges til at identificere de radikaler, der produceres og kan give et væld af oplysninger om arten og kinetikken af radikal produktionen 9.
De cykliske nitroner, 5,5-dimethyl-pyrrolin-N-oxid, DMPO 10, phosphoryl-substituerede DEPMPO 11, og den ester-substituerede, EMPO 12 og BMPO 13, er blevet udbredt anvendt som spin-fælder - sidstnævnte centrifugering fælder udstiller længere halveringstider for O 2 • - addukt. Jern (II)-N-methyl-D-glucamin dithiocarbamat, Fe (MGD) 2 </ Sub> er almindeligt anvendt til at indfange NO på grund af høj hastighed for adduktdannelse og den høje stabilitet af spin adduktet 14.
Protocol
1. Dyrkning af bovine aortiske endotheliale celler (BAEC)
- Korrekt aseptiske teknikker blev fulgt.
- I et vandbad, varmt medium uden antibiotika ved 37 ° C.
Bemærk: medium består af phenol fri Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 4,5 g / L D-glucose, 4 mM L-glutamin, 1% non-essentielle aminosyrer, suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 2,5 mg / L endotelvækstfaktor.
- Fjerne T75-kolbe, der indeholder celler fra inkubatoren og rense overfladen af kolben med 70% ethanol før det placeres inde i hætten.
- Fjerne den gamle medium med en aspirator og vaskes to gange med 5 ml Dulbeccos phosphat-buffer saltvand (DPBS).
- Tilsættes 2 ml trypsin og vente på 4-5 min for celler til at frigøre medens periodisk inspektion under et mikroskop.
- Tilsæt 3 ml af mediet og gentagne gange blandes med en pipette til at adskille than celler og skabe en ensartet suspension.
- Overfør 5 ml af medium med trypsin til et 15 ml rør og centrifugeres ved 121 g i 5 min.
- Fjern supernatanten under anvendelse af en aspirator. Tilsæt 5 ml DPBS og bland grundigt. Centrifugeres ved 121 g i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten ved tilsætning af 6 ml af mediet.
- På en 6-brønds plade tilsættes 1 ml af cellesuspensionen til hver brønd og derefter tilsættes 1 ml af mediet. Bland suspensionen ved hjælp af en pipette.
- Mærk pladen og inkuberes natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
2A. Påvisning af NO med BAEC Cell
- Korrekt aseptiske teknikker blev fulgt.
- Fjerne 6-brønds plade fra inkubatoren og aspirér medium fra den første brønd. Vask cellerne to gange med 1 ml DPBS.
- Tilsættes 210 ul 1,9 mM jern (II) sulfat-heptahydrat (FeSO4 0,7 H2O, fremstilles frisk ved at opløse 0,8 mg1 ml DPBS med CaCl2 og MgCl2) og 210 gl af ammonium N-methyl-D-glucamin dithiocarbamat (MGD, fremstilles frisk ved at opløse 2,7 mg i 500 pi DPBS med CaCl2 og MgCl2) med et forhold på 01:07 . (Bemærk: Dette forhold, hvor overskydende MGD anvendes er konventionelt anvendt til fremstilling af Fe2 +-MGD kompleks på grund af den kendsgerning, at udbyttet af Fe3 +-MGD maksimeres i nærvær af overskydende MGD Tilsætningen af ascorbat i opløsning for at stabilisere den Fe2 +-MGD er ikke nødvendigt, da NO-Fe3 dannet +-MGD er endogent reduceres til EPR detekterbare NO-Fe2 +-MGD af ascorbat, hydroquinon eller cystein med omdannelseseffektivitet på op til 99,9% .. Den lave centrifugering diamagnetisk tilstand Fe2 + muliggør påvisning af NO ved hjælp af flade celler eller kapillarrør uden behov for en lav temperatur enhed) 15.
- Swirl den resulterende suspension godt og tilsæt 4,6 μl calciumionophor (CAI) (fremstillet ud fra en stamopløsning af 1,9 mM ved at opløse 1 mg i 1 ml DMSO).
- Hvirvel opløsningen igen og inkuberes ved 37 ° C i 36 minutter for yderligere at muliggøre reduktion af NO-Fe3 +-MGD til EPR detekterbare NO-Fe2 +-MGD.
- Opsamle supernatanten (425 pi) i et Eppendorf-rør og overført til en EPR flad celle (eller til et 50 ul kapillarrør).
- EPR erhvervelse parametre er: mikrobølgeovn frekvens: 9,8 GHz; midterste felt: 3427 G, modulation amplitude: 6,0 G, feje bredde: 100 G; modtager gevinst: 1 x 10 5, mikrobølgeeffekt: 10 mW; samlede antal scanninger: 121; Sweep tid: 10 s, og tidskonstant: 20 ms (Bemærk: Siden parametre vil variere fra ét instrument og eksperimentelle betingelser til en anden, derfor kun det midterste felt, frekvens og modulation amplitude er de vigtigste parametre til at overveje.).
- Registrere spektre ved stuetemperatur, og 2-D-spektre blev intevurderet til at reducere baggrundsstøj og baseline korrigeres ved hjælp af Bruker WinEPR Databehandling software eller anden databehandling software. Til kvantificering af adduktdannelse, kan standard plot af koncentration vs signalintensitet (eller arealet) konstrueres ved hjælp af en NO-donor SNAP.
2B. eNOS Frakobling Experiment
- Fjerne 6-brønds plade fra inkubatoren og aspirér medium fra den anden brønd og vask to gange med 1 ml DPBS.
- En peroxynitrit donor, 5-amino-3-(4-morpholinyl) -1,2,3-oxadiazolium chlorid (SIN-1) blev anvendt til at koble eNOS 16. Tilsættes 100 ul 0,5 mM SIN-1 (Mr 206,6 g / mol, fra 10 mM stamopløsning frisk fremstillet ved at opløse 1 mg SIN-1 i 500 pi PBS uden Ca / Mg-ioner) og fortyndet til 2 ml med DPBS og 10% FBS.
- Inkuber i 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fjerne pladen fra inkubatoren og vaskes to gange med DPBS.
- Tilsættes 210 ul2,8 mM FeSO4 0,7 H2O og 210 pi af 19,6 mM MGD frisk fremstillet ifølge fremgangsmåden nævnt ovenfor.
- Swirl løsningen og tilsæt 4,6 gl 1,9 mM Cai.
- Hvirvel opløsningen igen og inkuberes ved 37 ° C i 36 min.
- Opsamle supernatanten (425 pi) i et Eppendorf-rør og overført til en EPR flad celle.
- EPR erhvervelse parametre er: mikrobølgeovn frekvens: 9,8 GHz; midterste felt: 3427 G, modulation amplitude: 6 G; Sweep bredde: 100 G; modtager gevinst: 1 x 10 5, mikrobølgeeffekt: 10 mW; samlede antal scanninger: 121; sweep tid: 10 s, og tidskonstanten: 20 ms.
- Registrere spektre og 2-D-spektre blev integreret for at reducere baggrundsstøj og basislinie korrigeret som nævnt ovenfor.
3. Detektion af O2 • - fra polymorfnukleære neutrofiler (PMN'er)
- Neutrofiler blev isoleret fra humant blod prøve som tidligere beskrevet 17.
- Foretag en stamopløsning af 1 M DMPO * i PBS indeholdende 0,1 mM diethylentriamin-pentaeddikesyre (DTPA). DMPO har et smeltepunkt på 25-29 ° C, så det er mere bekvemt at pipettere flydende DMPO (massefylde ~ 1,02 g / ml ved 25 ° C) i et hætteglas (Bemærk: ikke bruge plastik hætteglas til vejning, da ren DMPO reagerer med plast). Frozen DMPO kan smeltes ved at køre lunkent vand på hætteglasset (Bemærk: ikke løber varmt vand som DMPO kan nedbrydes).
- Det er vigtigt at anvende høj renhed DMPO (> 99%), da nogle af de kommercielt tilgængelige spin-fælder indeholde paramagnetiske urenheder, og det er derfor nødvendigt at køre EPR-spektret af kun DMPO opløsning alene (10 mM i dette tilfælde). Det er vigtigt, at ingen baggrund signal er klart (se figur 3A).
- Fremstille stamopløsning (1 mg / ml) af phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) i DMSO. Gøre alikvoter ved fortynding af opløsningen til 10 ug / ml i PBS.
- I en 1.5 ml eppendorfrør, fremstilles en opløsning med et totalt volumen på 0,6 ml ved at følge sekvensen tilsætningshastighed: ~ 10 6 celler pr ml af PMN, D-glucose (1 mg / ml) og albumin (1 mg / ml), 10 mM DMPO og 0,2 ug / ml PMA. (Bemærk: PMA er radikal aktivator og bør tilsat sidst).
- Opløsningen overføres til en EPR flad celle.
- EPR erhvervelse parametre er: mikrobølgeovn frekvens: 9,8 GHz; midterste felt: 3486 G, modulation amplitude: 0,5 g; Sweep bredde: 100 G; modtager gevinst: 5 x 10 5, antallet af scanninger: 10; Sweep tid: 30 s ; mikrobølgeeffekt: 20 mW, og tidskonstant: 81 ms. Til kvantificering af adduktdannelse, kan standard plot af koncentration vs signalintensitet (eller arealet) konstrueres ved hjælp af de stabile nitroxider såsom TEMPO eller 3-carboxylsyre-PROXYL.
* Vigtigt på anvendelse af DMPO: Ved at anvende en flad celle, kan man forøge celledensitet og derved forøge signalIntensiteten af centrifugering adduktet, men halveringstiden af O2 • - addukt af DMPO er kort (t 1/2 ~ 1 min), som dekomponerer til DMPO-OH. DMPO kan substitueres med de samme koncentrationer af EMPO, BMPO eller DEPMPO der er kommercielt tilgængelige for øget addukt stabilitet med t 1/2 ~ 8 og 14 min.
4. Repræsentative resultater
Spinde indfangning af NO radikal blev udført under anvendelse af Fe2 +-MGD. Figur 2A og 2B viser ingen EPR signalet fra Fe2 +-MGD eller en blanding af Fe2 +-MGD med CAI, indikerer, at ingen NO baggrundssignal stammer fra disse reagenser. BAEC efter stimulering med CAI frigiver NO som reagerer med Fe2 +-MGD til dannelse af centrifugering adduktet, NO-Fe2 +-MGD, og viser et karakteristisk triplet signal med hyperfine spaltning konstant (hfsc) værdi af N = 12,66 G og g-faktor g = 2,040. (Figur 2C). HFSC-værdien blev bestemt ved anvendelse af WINSIM simulation program, der kan downloades fra NIEHS EPJ Software Database hjemmeside. Den eksperimentelle hfsc er i overensstemmelse med litteraturen værdien af en N = 12,70 G og G = 2,041 18 til NO-Fe2 +-MGD addukt. Tilsvarende virkningen af SIN-1 på BAEC sænket NO-produktion på grund af eNOS frakobling som vist i figur 2D.
DMPO spin-fælde blev brugt til O 2 • - detektion. DMPO alene gav ikke et signal som vist i figur 3A bekræftede, at spin-fælde er fri for paramagnetiske urenheder. Figur 3B er spektret af DMPO og PMN'er alene, og lignende, der ikke er noget detekterbart signal tyder på, at DMPO ikke forårsager aktivering af enzymet NADPH-oxidase. Figur 3C viser det observerede EPR signalet efter stimulering af PMN med PMA. De hfsc værdier for dette signal blev bestemt til at være en N = 14,71 G, A β-H = 11,40 G og en γ-H = 1,25 g, og er i overensstemmelse med værdier fra litteraturen for en N = 14,3 g, en β-H = 11,7 G og en γ-H = 1,3 G 19 til DMPO-O 2 H addukt.
Figur 1. Rutediagram for påvisning af radikaler fra neutrofile og baec ved hjælp af EPR spin-trapping. (A) PMN'er blev blandet med DMPO og PMA, og den resulterende blanding overføres til en EPR flad celle til dataopsamling. (B) BAEC blev dyrket på en plade og vasket med DPBS. Spin trap Fe (MGD) 2 blev tilsat sammen med CAI. Opløsningen blev blandet grundigt og inkuberet. Blandingen blev overført til en EPR flad celle EPR dataopsamling.
Figur 2. EPR detektion af NO fra BAEC. (A) spektrum af Fe2 +-MGD alene (B) spektrum af Fe2 +-MGD + Cai alene. (C) Triplet-spektrum som følge af NO indfangning ved Fe2 +-MGD anvendelse CAI-stimulerede celler. (D) Spectrum viser fald i NO-produktion på grund af 0,5 mM SIN-1 behandling af celler.
Figur 3. EPR påvisning af DMPO-O 2H fra aktiverede neutrofiler. (A) spektrum af 10 mM DMPO alene. (B) spektrum af PMN alene i nærvær af 10 mM DMPO. (C) spektrum af PMN aktiveret med PMA i nærvær af 10 mM DMPO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EPR spin-trapping har været ansat i en bred vifte af biomedicinske anvendelser til kvantificering og identifikation af frie radikaler. Spin trapping er meget følsom, er i stand til at detektere radikaler ved koncentrationer i området fra nM til uM, hvilket således gør den egnet til anvendelse i biologiske systemer. Dannelsen af den paramagnetiske addukt, NO-Fe 2 +-MGD, er grundlaget for NO detektion via EPJ. Fe2 +-MGD reagerer med NO hurtigt 18 med en hastighed på ~ 10 6 M-1s-1. NO-Fe 2 +-MGD addukt har en lang halveringstid, og er meget stabil. Faktisk kan man opnå EPR-spektre i 24 timer efter at prøverne er blevet indsamlet ved frysning opløsningerne ved -80 ° C indeholdende NO-Fe2 +-MGD uden signifikant tab i signalintensitet (upublicerede resultater). Den ulempe, Fe2 +-MGD, at det er luftfølsomme og kræver sædvanligvis blande 5 eller flere molære ækvivalenter af liganden tilFe (II). Oxidation af Fe2 +-MGD til Fe3 +-MGD af luft uundgåelig og vanskelig at styre, men i in vitro og in vivo-systemer, er NO-Fe3 +-MGD dannet addukt reduceres biologiske reduktanter til EPR påviselige addukt NO-Fe 2 +-MGD 15, hvorfor det er nødvendigt for ascorbat Derudover kan udelades.
EPR kan også anvendes til at detektere O2 • - i biologiske systemer, der anvender nitron centrifugering fælder. Som et eksempel viser figur 3C spin trapping hjælp DMPO af O2 • - fra PMA-aktiverede PMN. En ulempe ved anvendelse af DMPO som spin trap er, at hastigheden af O2 • -/HO 2 • Foruden DMPO er meget langsom (<1 M-1 s-1) ved neutral pH, som kræver anvendelse af høje koncentrationer af DMPO ( 10-100 mM) for biologiske spin-fældefangst applikationer. Desuden DMPO-O 2 H halveringstid er kort (<1 min) 20 </ Sup> som nedbrydes DMPO-OH på grund af tilstedeværelsen af β-hydrogen, og mangler målspecificitet gør bestemmelsen af lokaliteten af radikalproduktion fra cellen tvetydige. Succes O2 • - detektion afhænger af celler, der anvendes. For eksempel genererer humane neutrofiler ved stimulering betydelig strømning af O2 • - som let kan detekteres ved anvendelse DMPO men man skal være opmærksom når det drejer sig andre typer af celler, hvor radikal produktion er signifikant mindre robust (f.eks endothel eller epiteliale celler). Adskillige nitroner er blevet udviklet til at forøge halveringstiden af de af O2 • - addukt, såsom anvendelse af EMPO og BMPO med halveringstider på 7-8 min 12, 13 og DEPMPO hvilket giver den længste halveringstid 14 min 21. Men satserne for spin-fældefangst med O 2 • - af disse spin-fælder stadig langsomt i forhold til DMPO, og derfor stadig kræver brug af høje koncentrationerning af de spin-fælder. Anvendelse af tilfældigt methyleret-β-cyclodextrin (Me-β-CD) som et co-reagens er også blevet anvendt til at forøge centrifugering indfangning evne nitroner for O2 • -. For eksempel under anvendelse af isoleret thylakoid membran og fotosystem II partikler viste Snyrychova 22 højere signalintensitet og addukt stabilitet for EMPO-O 2 H i nærvær af Me-β-CD i forhold til EMPO alene. Det anbefales kraftigt at sammenligne signalintensiteterne genereret fra nitronen-O 2 H i nærvær og fravær af Me-β-CD. Desuden har målet specificiteten af spin fælder også været en begrænsning. Bestræbelserne på at udvikle mere forbedrede spin-fælder, der tager deres dårlige reaktivitet til O 2 • -, kort addukt halveringstid og mål specificitet i en molekylær design er nu i gang 23-26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH National Heart, Lung, og Blood Institute tilskud RO1 HL81248.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol free DMEM medium High glucose 1X |
GIBCO | 31053 | |
| 0.25% Trypsin- EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| MEM Non Essential Amino acids | GIBCO | 11140 | |
| Fetal Bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Endothelial Growth factor | Millipore | 02-102 | |
| CaI | Enzo Life Sciences | A-23187 | Dissolve in DMSO |
| SIN-1 | Enzo Life Sciences | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo Laboratories | D048-10 | |
| FeSO4.7H2O | Sigma Aldrich | 215422-250G | Dissolve in PBS with Ca and Mg |
| MGD | Enzo Life Sciences | ALX-400-014-M050 | Dissolve in PBS with Ca2+ and Mg2+ |
| BAEC cells | Cell Systems | 2B2-C75 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| DPBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate acetate (PMA) | Sigma Aldrich | 79346-1MG |
References
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. Clerch, L. B., Massaro, D. J. , (1997).
- Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths. Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).
- Sumimoto, H. Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species. FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).
- Ignarro, L. J. Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , Academic Press. San Diego, CA. (2009).
- Moreau, M. Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes. Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).
- Vasquez-Vivar, J. Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping. Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).
- Frejaville, C. 5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).
- Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P.
- Villamena, F. A., Zweier, J. L. Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).
- Tsuchiya, K. Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD. Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).
- Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues. Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).
- RojasWahl, R. U. Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities. J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).
- Klempner, M. S., Gallin, J. I. Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations. Blood. 51, 659-669 (1978).
- Pou, S. Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies. Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).
- Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones. J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).
- Britigan, B. E., Rosen, G. M. Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical. J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).
- Frejaville, C. 5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals. J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).
- Snyrychova, I. Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles. Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).
- Han, Y. Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies. J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).
- Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate. J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).
- Hardy, M. Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap. Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).
- Kim, S. -U. Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies. J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).
