Summary
को बनाए रखने के लिए, पता लगाने के लिए और अनुक्रम एवियन इन्फ्लुएंजा वायरस से शाही सेना के लिए एक विधि मान्य और पक्षियों से प्राकृतिक मल के नमूने का उपयोग करते हुए विस्तारित किया गया था. इस तकनीक में एक शांत श्रृंखला और संक्रामक वायरस के संचालन को बनाए रखने की आवश्यकता को हटा और एक 96 अच्छी तरह से उच्च throughput सेटअप में लागू किया जा सकता है.
Protocol
1. बतख फँसाने और Cloacal swabbing
- ट्रैप लालच बतख या भोजन के साथ उन्हें आकर्षित करने के एक पिंजरे में जीनस अनस (या अन्य पक्षियों) के बतख dabbling, और उन्हें अलग - अलग कार्ड बोर्ड के बक्से में डाल दिया. बॉक्स में परिवहन के समय एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए जाल के लिए एक छोटी दूरी के भीतर किसी फ़ील्ड स्टेशन की स्थापना के द्वारा, उदाहरण के लिए,. उपस्कर परिस्थितियों प्रत्येक अध्ययन में भिन्न हो सकते हैं. सलाह और प्रासंगिक जानवर नैतिकता समिति के अनुमोदन के लिए प्रत्येक नए सेट अप के लिए मांग की जानी चाहिए. वैकल्पिक रूप से, यह भी शिकारी शॉट पक्षियों को जांचा जा सकता है.
- अपने पंख अपने शरीर को तंग पकड़े द्वारा बॉक्स के बाहर बतख लो. एक ताजा छोड़ने, जो अधिकांश मामलों में मौजूद बॉक्स के नीचे से सीधे हो जाएगा नमूना. उन्हें उठाओ और एक बाँझ झाड़ू के साथ एक वाटमान एफटीए कार्ड के लिए तरल पदार्थ लागू. यदि नहीं, cloacal swabbing करते हैं.
- बतख को अपनी पीठ पर मुड़ें. इस क्लोअका का उपयोग परमिट और नमूने की सुविधा. क्लोअका एक उभड़नेवाला पेट के नीचे स्थित, पूंछ के आधार पर करीब संरचना है. एक अनुभवी व्यक्ति पकड़ और पक्षी नमूना सकता है एक ही समय में, या किसी और एक दूसरे व्यक्ति की सहायता कर सकते हैं.
- ध्यान बाँझ प्लास्टिक रेयान (Copan, इटली) झाड़ू लगभग 1 सेमी डालने और क्लोअका का एक सौम्य ज़ुल्फ़. क्लोअका से एक वाटमान एफटीए कार्ड की सतह पर तरल पदार्थ के साथ झाड़ू रोल. बाद नमूना प्रदर्शन किया गया है जानवर की तत्काल रिहाई वांछनीय है.
- एफटीए कार्ड कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए सूखी है, तो प्रत्येक नमूने व्यक्तिगत स्टोर पेपर बैग (जैसे लिफाफे) में. भंडारण कमरे के तापमान पर संभव है, उमस भरे मौसम में सिलिका मोतियों के साथ संभवतः,. भेजने और 'संस्थाओं जैव सुरक्षा अधिकारियों प्राप्त नियमित मेल द्वारा मुक्त व्यापार समझौते कार्ड भेजने के लिए, के बाद से रोगज़नक़ों एफटीए कार्ड की सतह के साथ संपर्क पर निष्क्रिय हो अनुमति कर सकते हैं.
2. वायरल शाही सेना अलगाव
- एफटीए कार्ड मल / cloacal तरल पदार्थ सहित सामग्री निकालें. पंच हैरिस 2 मिमी छेदने का शस्र और एक RNase मुक्त 96well थाली के एक कुएँ में उन सभी जगह के साथ तीन डिस्क. प्रत्येक नए नमूने के बीच, छेदने का शस्र ध्यान से साफ शराब और किम सटीक पोंछ (Kimtech) के साथ. हमेशा सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें. एक सकारात्मक नियंत्रण प्रयोगशाला हौसले एक मुक्त व्यापार समझौते कार्ड के लिए आवेदन किया, तनाव, या एक प्राकृतिक नमूना है जो एक सकारात्मक परिणाम उपज पता है से मिलकर कर सकते हैं. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक खाली एफटीए कार्ड से बाहर डिस्क पंच. इसके अतिरिक्त, एक अच्छी तरह से एक पीसीआर अपने प्रयोग में बाद में नियंत्रण के लिए मुक्त छोड़ (टेम्पलेट के रूप में पानी के साथ).
- 70μl शाही सेना तेजी से निष्कर्षण (Ambion) समाधान और गर्मी सील प्लेट (AbGene थर्मो - मुहर) जोड़ें. कमरे के तापमान पर निर्धारित गति है कि फैल पर कारण नहीं करता है (, अग्रिम में परीक्षण इस्तेमाल किया प्लेट प्रकार के बरतन मॉडल पर निर्भर करता है) के साथ एक थाली प्रकार के बरतन पर 5 मिनट सेते हैं.
- निर्माता MagMAX-96 वायरल शाही सेना अलगाव किट (Ambion) के साथ प्रोटोकॉल के अनुसार वायरल शाही सेना अलगाव कैर्री. संक्षेप में: जोड़ें 130μl तैयार lysis / प्रत्येक अच्छी तरह के लिए बाध्य समाधान किट (से). स्थानांतरण 50μl प्रत्येक अच्छी तरह से मुक्त व्यापार समझौते कार्ड सामग्री निकाली गई. 1 मिनट के लिए थाली हिलाएँ.
- प्रत्येक नमूना और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 20μl तैयार मनका मिश्रण (किट) से जोड़ें. 5 मिनट के लिए निर्धारित गति पर हिलाएँ. शाही सेना अणु चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य होगा.
- एक चुंबकीय थाली ले जाएँ 96 अच्छी तरह मोती कब्जा खड़े. चुंबकीय इस्तेमाल किया स्टैंड के मॉडल पर निर्भर करता है, यह 5 मिनट से अधिक ले सकते हैं. जब समाधान पूरी तरह से स्पष्ट कर दिया गया है निकालने के लिए, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. फिर स्टैंड से चुंबकीय थाली हटा दें.
- धो एक समाधान के साथ और दो बार धोने समाधान 2 (किट) से के साथ मोती दो बार धो. 4 धोने कदम के प्रत्येक प्रत्येक नमूने के 150μl तैयार धोने समाधान जोड़ने शेक, निर्धारित गति पर 1 मिनट के लिए, चुंबकीय खड़ा करने के लिए थाली ले जाने के लिए, के बारे में 5 मिनट के लिए मोती कब्जा (या जब तक पूरी तरह से स्पष्ट समाधान है) निकालने के लिए, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. फिर चुंबकीय स्टेंड से थाली निकालने के लिए, अगले धोने समाधान जोड़ने के लिए, और बाहर धोने कदम के रूप में पहले से ले. पिछले धोने कदम के बाद, संभव है और हवा 2 मिनट के लिए थाली प्रकार के बरतन में सूखी कमरे के तापमान पर मोती के रूप में के रूप में ज्यादा धोने समाधान निकालने.
- मोतियों से शाही सेना की रिहाई और थाली प्रकार के बरतन पर 4 मिनट के लिए हिला elution बफर के 50μl (किट) से जोड़ें. मोती के रूप में पहले वर्णित कैप्चर. सतह पर तैरनेवाला अब पृथक शाही सेना है जो बहाव के अनुप्रयोगों के लिए तैयार है.
3. RT-पीसीआर AIV मैट्रिक्स जीन की
25 μl प्रतिक्रियाओं में एक कदम प्रवेश RT-पीसीआर प्रणाली के साथ रिवर्स प्रतिलेखन (RT-पीसीआर) पीसीआर (Promega) कैर्री (Kraus एट अल से समायोजित 18 और 22 Fouchier एट अल.) के लिए:
| Nuclease मुफ्त पानी | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 बफर 5μl | |
| dNTPs | 0.5μl |
| प्राइमर 22 (10 सुक्ष्ममापी) M52C | 2.5μl |
| प्राइमर 22 (10 सुक्ष्ममापी) M253R | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 मिमी) | 7μl |
| AMV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (5u/μl) | 0.5μl |
| टीएफएल पोलीमरेज़ (5u/μl) | 0.5μl |
| शाही सेना नमूना | 5μl |
एक Biometra T1 thermocycler में पीसीआर शर्तों रहे हैं: 45 पर 45 मिनट की प्रारंभिक रिवर्स प्रतिलेखन डिग्री सेल्सियस, 94 पर 2 मिनट प्रारंभिक विकृतीकरण द्वारा पीछा ° सी और के 40 चक्र: 94 ° C 1 मिनट, 1 मिनट के लिए 56 ° सी, और के लिए 68 ° C 2 मिनट के लिए. 68 से कम एक अतिरिक्त 7 मिनट बढ़ाव डिग्री सेल्सियस प्रवर्धन निष्कर्ष निकाला है.
4. ऐ सकारात्मक नमूने के लिए स्क्रीनिंग और लक्षित टुकड़े की जेल से शोधन
- पीसीआर उत्पाद 5x 2μl लोड हो रहा है (BioRad) एक 1% agarose जेल (Roche) 1% एक पूर्व स्क्रीनिंग के लिए ethidium ब्रोमाइड (प्रति 100 मिलीलीटर जेल 2.5μl) के साथ दाग और 6μl पानी डाई के साथ मिश्रित की 2μl लोड.
- 120V से कम 1 घंटे के लिए जेल के साथ एक डीएनए आकार मानक (BioRad ईज़ी लोड 100 बीपी सीढ़ी), भागो, एक जेल प्रलेखन प्रणाली के साथ कल्पना. चित्रा 1 में एक उदाहरण देखें.
- उम्मीद की आकार सीमा में परिलक्षित टुकड़े (200 बीपी और 300 बीपी (लक्ष्य टुकड़ा 244 बीपी) के बीच के साथ नमूने का चयन करें 6μl 5x लोडिंग डाई के साथ एक 2 पर इन उम्मीदवारों की पूरी पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा (जो 23μl ~ कर रहे हैं छोड़ दिया) लोड. % ethidium ब्रोमाइड agarose जेल सना हुआ और 2 घंटे के लिए चलाए.
- एक यूवी transilluminator (Bioblock वैज्ञानिक) पर जेल प्लेस और नेत्रहीन का निरीक्षण. चित्रा 2 में एक उदाहरण देखें. सही आकार की एक स्केलपेल और व्यक्तिगत 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में रखा के साथ जेल से आबकारी बैंड. जेल से टुकड़े Zymoclean जेल डीएनए वसूली किट (Zymo रिसर्च) के साथ उदाहरण के लिए शुद्ध.
5. अनुक्रमण और पीसीआर उत्पाद की पहचान
- एक अबी 3730 अबी बिग डाई 3.1 रसायन विज्ञान (एप्लाइड Biosystems) के साथ केशिका sequencer के लक्ष्य टुकड़े के सेंगर उदाहरण के लिए, अनुक्रमण कैर्री. 10μl युक्त मात्रा में अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं तैयार 10-20 एनजी जेल सीडीएनए टेम्पलेट, 1.75μl 5x कमजोर पड़ने बफर, 0.5μl बिग डाई V3.1 premix, 1 μl आगे प्राइमर (20 M52C, 10 मिमी), और ddH2O शुद्ध. 1 मिनट प्रारंभिक विकृतीकरण के 25 चक्र द्वारा पीछा किया:: सायक्लिंग शर्तों एस 96 पर 10 डिग्री सेल्सियस, 5 और 45 डिग्री सेल्सियस और 60 पर 4 मिनट पर डिग्री सेल्सियस शुद्ध और अनुक्रमण अपने आंतरिक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रतिक्रिया तैयार.
- GenBank23 रूप में nucleotide डेटाबेस है, जैसे के लिए राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना (NCBI, केंद्र पर बम विस्फोट के रूप में वेब आधारित उपकरण द्वारा खिलाफ सीडीएनए दृश्यों परिणामस्वरूप पहचानें http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. प्रतिनिधि परिणाम:
Mallards (अनस platyrhynchos) Ottenby दिसंबर 2007 में बर्ड वेधशाला में नमूना थे. प्रत्येक जंगली बत्तख़ से मुक्त व्यापार समझौते कार्ड पर एक नमूना लिया गया था इस प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित है. शिपिंग के बाद, मुक्त व्यापार समझौते कार्ड दो साल के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में रखा गया था. प्रयोगशाला का एक ही मुक्त व्यापार समझौते कार्ड नमूना Kraus एट अल में परीक्षण अलग 18 सकारात्मक नियंत्रण है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह के नौ दस गुना धारावाहिक dilutions के रूप में शामिल किया गया था. दो नकारात्मक नियंत्रण मैं थे) एक खाली एफटीए कार्ड से निकासी, परीक्षण करने के लिए अगर वहाँ था छेदने का शस्र से ऊपर ले जाने, और ii) प्रतिक्रिया RT-पीसीआर में जो nuclease मुफ्त पानी टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था, के लिए परीक्षण अगर संदूषण के दौरान हुई, या पीसीआर प्रतिक्रिया की तैयारी में है.
84 नमूनों का विश्लेषण किया गया. इन 84 नमूनों से पीसीआर उत्पादों की एक जेल चित्र चित्र 1 में पाया जा सकता है. प्राकृतिक नमूनों से unspecific बैंड के एक भीड़ के मल में विभिन्न माइक्रोबियल contaminations की उपस्थिति की वजह से देखा जा सकता है. हालांकि, प्राइमर जोड़ी का लक्ष्य टुकड़ा 244 बीपी लंबा है. नमूने जो लगभग सही आकार सीमा (200 बीपी और 300 बीपी के बीच) में उत्पादित टुकड़े का एक सबसेट की पूरी मात्रा पीसीआर प्रतिक्रिया जेल (चित्रा 1) पर लोड किया गया था. पूरक चित्रा 1 में एक उदाहरण है जो बैंड की जेल से काट रहे थे पाया जा सकता है. सकारात्मक नियंत्रित करने के लिए इसके अलावा, इन नमूनों की (69,899 और 69,912) दो नए प्रोटोकॉल के द्वारा सकारात्मक थे. NCBI nucleotide डेटाबेस के खिलाफ एक विस्फोट खोज ऐ मैट्रिक्स जीन (चित्रा 3) के रूप में उनकी पहचान का पता चला, जबकि अन्य सभी बैंड बैक्टीरियल दृश्यों सबसे निकट मची, या सभी पर उपज नहीं एक पठनीय अनुक्रम.
चित्रा 1. जेल चित्र 2 सकारात्मक नियंत्रण के μl पीसीआर उत्पाद है, पीसीआर के उत्पादों की प्रारंभिक जांच की .सकारात्मक नियंत्रण, दो नकारात्मक नियंत्रण और 84 cloacal नमूने के erial dilutions भरी हुई थी. शीर्ष जेल पैनल, और वह नीचे के पैनल में 48 नमूनों में 48 नमूने दिखाए जाते हैं. लाल तीर जेल 100 बीपी डीएनए आकार मानक के लिए इस्तेमाल किया गलियों से संकेत मिलता है. उदाहरण के लिए, लाल हलकों की उम्मीद आकार सीमा में बैंड दिखा. ब्लू हलकों एक unspecific (ऊपर छोड़ दिया) amplicon या आकार में 100 बीपी (नीचे सही) के नीचे एक किताब डिमर मूर्ति से संकेत मिलता है.
चित्रा 2. 200 बीपी और 300 बीपी (लक्ष्य टुकड़ा 244 बीपी) के बीच बैंड के साथ सही आकार की सीमा में टुकड़े के साथ नमूने का चयन नमूने चुने गए. हरी तीर सकारात्मक नियंत्रण इंगित करता है, दो लाल तीर नमूने जो NCBI nucleotide डेटाबेस के लिए अपने सीडीएनए दृश्यों की तुलना द्वारा AIV सकारात्मक होना पुष्टि की गई है संकेत मिलता है.
चित्रा 3. NCBI में एक प्रतिनिधि ब्लास्ट खोज की स्क्रीन पर कब्जा excised टुकड़े से प्राप्त सीडीएनए दृश्यों में से एक nucleotide के डेटाबेस के विरुद्ध NCBI वेबसाइट पर पूछे किया गया था. नमूना ऐ मैट्रिक्स जीन टुकड़ा के रूप में सही ढंग से पहचान की है. इस छवि के एक पूर्ण आकार के संस्करण देखने के लिए, यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा S1. चयनित जेल से excised नमूने के बैंड 200 बीपी और 300 बीपी के बीच उम्मीदवार बैंड के बाद चित्र 1 में दिखाया गया जेल से इस चित्र लिया गया था. बाहर काट रहे थे.
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक अनुपूरक विधि AIV की उपस्थिति के लिए मल या इसी तरह के नमूने स्क्रीन प्रदान करता है. यह विशेष रूप से नमूना संग्रह त्वरित और आसान बनाने के लिए डिजाइन किया गया था. यह शिकारी या वन्यजीव प्रबंधकों जैसे कम प्रशिक्षित व्यक्तियों, ऐ निगरानी के लिए योगदान के लिए यह संभव बनाता है. नहीं शांत श्रृंखला के लिए लागू किया जाना चाहिए, हालांकि नमूने ठंड जहां संभव हो सिफारिश की है. कमरे के तापमान के कुछ दिनों के, उदाहरण के लिए प्रयोगशाला में परिवहन के दौरान मुक्त व्यापार समझौते कार्ड पर शाही सेना अणु के लिए एक समस्या नहीं थे, के रूप में लंबे समय के रूप में कार्ड शुष्क बने रहे. अन्य गैर ठंडा भंडारण प्रणालियों है कि वर्तमान में अनुसंधान समुदाय द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं 15 शराब या guanidine 16 के रूप में, अपने खतरनाक प्रकृति की वजह से से विशेष शिपिंग व्यवस्था की आवश्यकता है. इसके विपरीत, मुक्त व्यापार समझौते कार्ड विधि खतरनाक सामग्री की शिपिंग आवश्यकता नहीं है. हालांकि, इस संबंध में एक और दिलचस्प भंडारण माध्यम RNAlater ™ है कि खतरनाक नहीं है, 17 या तो है. किसी भी मानक आणविक प्रयोगशाला में नमूना विश्लेषण किया जा सकता है. कोई विशेष सामान्य प्रतिक्रियाओं पीसीआर और केशिका अनुक्रमण के लिए की तुलना में अन्य उपकरणों की जरूरत थी. सभी चरणों का एक जैव सुरक्षा स्तर के बिना बाहर किया जा सकता है क्योंकि नमूना संग्रह पर पहले से ही संभावित रोगजनक एजेंटों एफटीए कार्ड के जीवाणुरोधी और antiviral गतिविधि के द्वारा निष्क्रिय किया गया.
क्रॉस संदूषण और बाद में झूठी सकारात्मक नमूने हमारे परीक्षणों में जंगली पक्षियों के नमूनों के साथ मनाया गया. हालांकि, जब शाही सेना और पीसीआर के साथ काम कर रहे यह हमेशा उचित है पर विशेष ध्यान देना करने के लिए स्थानों और पूर्व और बाद पीसीआर के चरणों के लिए अलग कमरे काम कर साफ. एक धूआं हुड में कार्य प्रयोगशाला में एयरोसोल संदूषण का जोखिम कम हो जाती है. Pipetting बाहर फिल्टर सुझावों के साथ किया जाना चाहिए.
एक साथ एक ही बतख हम जानते हैं कि 84 नमूनों की छह पारंपरिक RealTime द्वारा सकारात्मक RT-पीसीआर 24 विधि और RealTime RT-पीसीआर से सीटी मान जाना जाता है थे से ली गई नमूनों पर पिछले एक अध्ययन से. दो सकारात्मक नमूने हमारे बतख है जो सीटी <30 (वायरल शाही सेना के एक उच्च एकाग्रता का संकेत) मान से स्टेम विधि द्वारा पता लगाया. अन्य चार नमूने जो पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ सकारात्मक थे सीटी मूल्यों> (कम केंद्रित) 30 और हमारे प्रोटोकॉल द्वारा नहीं पाया जा सकता था.
अपेक्षाकृत उच्च वायरस titers के साथ केवल नमूने हमारी परख में सकारात्मक थे और यह संभावना है कि विधि की संवेदनशीलता के लिए सभी सकारात्मक नमूनों का पता लगाने की विफलता के स्रोत था. इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन में नमूने का आकार बहुत कम था और विधि पूरी तरह से विकसित किया जा मूल्यांकन अगर अधिक नियंत्रित और कठोर प्रयोगों बाहर किया जाता है. हालांकि, अगर इन नमूनों को एक दूरदराज के इलाके से एकत्र किया गया होता है, पारंपरिक विश्लेषण संभव बिल्कुल नहीं होता. इसके अतिरिक्त, इन पहला परिणाम पायलट प्रयोगों जो आगे अनुकूलन की जरूरत है से स्टेम. नमूना संग्रह के बाद एक नियमित रूप से -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में दो साल के भंडारण की एक अवधि शायद भी वायरल शाही सेना की गुणवत्ता से प्रभावित है. यह संभव आरएनए गिरावट एक महत्वपूर्ण मुद्दा है जब कमरे निष्क्रिय वायरस के तापमान भंडारण के साथ काम कर. वैकल्पिक तरल पदार्थ में जमा के रूप में उपर्युक्त नमूने महत्वपूर्ण गिरावट है जो वायरल जीनोम 16 की लंबी हिस्सों के विश्लेषण के प्रभावों से पीड़ित हैं. हालांकि हमारे अध्ययन में परीक्षण नहीं किया है, मुक्त व्यापार समझौते कार्ड को अच्छी तरह से अन्य आरएनए प्रणाली है कि बहुत एवियन इन्फ्लुएंजा 25 वायरस, 26 के लिए इसी तरह की हैं बरकरार शाही सेना अणु संरक्षित करने के लिए अनुकूल साबित किया है.
Disclosures
फँसाने, हैंडलिंग और पक्षियों के नमूने राष्ट्रीय कानून का पालन किया गया और स्वीडिश कृषि और अनुसंधान जानवर नैतिकता समिति के बोर्ड द्वारा अनुमोदित थे.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
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