Summary
En metod för att bevara, upptäcka och sekvens RNA aviära influensavirus var validerade och förlängda med hjälp av naturliga träckprov från fåglar. Denna teknik tar bort behovet av att upprätthålla en cool kedja och hantering av smittsamt virus och kan tillämpas i ett 96-väl hög genomströmning setup.
Abstract
Aviära influensavirus (AIVs) infektera många däggdjur, inklusive människan 1. Dessa AIVs är mångskiftande i sin naturliga värdar, hysande nästan alla tänkbara virala subtyper 2. Mänskliga pandemier av influensa härrör ursprungligen från AIVs 3. Många dödliga humanfall under H5N1 utbrott under de senaste åren rapporterades. Nyligen, en ny AIV relaterade stam svepte genom den mänskliga befolkningen, vilket gör att "svininfluensan" 4. Även om mänskliga handel och transport aktivitet verkar vara ansvariga för spridning av högpatogen stammar 5, kan spridning också delvis bero på vilda fåglar 6, 7. Men den verkliga reservoar av alla AIV stammar vilda fåglar.
Som reaktion på detta och inför svåra kommersiella förluster i fjäderfänäringen, har stora övervakningsprogram genomförts globalt för att samla in information om ekologi AIVs och installera system för tidig varning för att upptäcka vissa högpatogena virusstammar 8-12. Traditionella virologiska metoder kräver virus vara intakt och odlas före analys. Detta kräver stränga kylan kedjor med djup frysar och tunga biosäkerhet förfaranden som ska på plats under transport. Långsiktig övervakning är därför vanligen begränsad till ett fåtal fältstationer nära till välutrustade laboratorier. Avlägsna områden kan inte ta prov om logistiskt tungrodda förfaranden genomförs. Dessa problem har redovisats 13, 14 och användning av alternativa lagring och strategier för transport undersökas (alkoholer eller guanidin) 15-17. Nyligen introducerade Kraus et al. 18 en metod för att samla in, lagra och transportera AIV prover, baserat på ett speciellt filtrerpapper. FTA-kort 19 bevara RNA på en torr lagring bas 20 och göra patogener inaktiva vid kontakt 21. Denna studie visade att FTA-kort kan användas för att upptäcka AIV RNA i omvänd transkription PCR och att den resulterande cDNA kunde sekvenseras och gener virus och fastställas.
I studien av Kraus et al. 18 ett laboratorium isolat av AIV användes, och prover hanteras individuellt. I förlängningen presenteras här var träckprov från vilda fåglar från anka fällan vid Ottenby fågelstation (SE Sverige) testade direkt att illustrera nyttan av de metoder under fältförhållanden. Fångst av änder och provtagning av kloaksvabbprov visas. Det nuvarande protokollet innefattar skalökning av arbetsflödet från enstaka rör hanteringen till en 96-bra design. Även mindre känsliga än de traditionella metoderna, ger metoden av FTA-kort ett utmärkt komplement till stor bevakning system. Det gör att insamling och analys av prover från var som helst i världen, utan att behöva upprätthålla en cool kedja eller säkerhetsföreskrifter med avseende på frakt av farligt reagens, som alkohol eller guanidin.
Protocol
1. Duck Svällning och svabbprover svabbar
- Trap simänder av släktet Anas (eller andra fåglar) i en bur genom att locka dem med drag ankor eller mat, och sätta dem i enskilda boxar kartong. Transport tid i rutan bör hållas till ett minimum, till exempel genom att installera en fältstation inom ett kort avstånd till fällan. Logistiska förhållanden kan variera i varje studie. De råd och godkännande av de berörda animaliska etiska kommitté behöver sökas för varje ny uppsättning. Alternativt även jägaren sköt fåglar kan ta prov.
- Ta anka ur lådan genom att hålla vingarna tätt till kroppen. Exempel på en ny släppa, som kommer att finnas i de flesta fall, direkt från botten av lådan. Plocka upp dem med en steril kompress och tillämpa vätska till en Whatman FTA-kort. Om inte, gör svabbprover svabbar.
- Vänd anka på ryggen. Detta ger tillgång till kloak och underlättar provtagning. Den kloak är en utskjutande struktur ligger under buken, nära svansroten. En erfaren person som kunde hålla och smaka fågeln på samma gång, annars en andra person kan hjälpa.
- Försiktigt in den sterila plast rayon kompress (Copan, Italien) ca 1 cm och göra en mjuk virvel av kloak. Rulla pinnen med vätskor från kloak över ytan av en Whatman FTA-kort. Efter provtagning har utförts omedelbart frisläppande av djuret är önskvärt.
- Torka FTA korten i rumstemperatur i minst 1 timme, sedan lagra varje prov för sig i papperspåsar (t ex kuvert). Är möjlig vid rumstemperatur, eventuellt med kiseldioxid pärlor i fuktiga klimat. Den sändande och mottagande institutionernas biosäkerhet officerare kan tillåta att sända FTA-kort via vanlig post, eftersom patogener blir inaktiva vid kontakt med FTA-kort ytan.
2. Viralt RNA Isolering
- Extrahera FTA-kort material inklusive avföring / svabbprover vätska. Punch tre skivor med ett Harris 2 mm hålslag och placera alla dessa i en brunn på en RNas gratis 96well plattan. Mellan varje nytt prov, rengör hålslag försiktigt med alkohol och en Kim precision torka (Kimtech). Använd alltid positiva och negativa kontroller. En positiv kontroll kan bestå av ett laboratorium stam nyligen tillämpas på ett frihandelsavtal kort, eller fysiska prov som vet att ge ett positivt resultat. Som negativ kontroll, Punch Out skivor från ett tomt FTA-kort. Dessutom lämnar annan väl fri för en PCR-kontroll senare i experimentet (med vatten som mall).
- Lägg 70μl RNA snabb extraktionslösning (Ambion) och värmeförseglingspressar plattan (AbGene Thermo-Sealer). Inkubera 5 minuter på en tallrik shaker vid rumstemperatur med den fastställda hastigheten som inte orsakar spill-over (detta beror på vilken tallrik shaker modellen, testa i förväg).
- Bär virus-RNA isolering enligt tillverkarens protokoll med MagMAX-96 viralt RNA isolering kit (Ambion). I korthet: Lägg 130μl förberedda lys / bindande lösning (från kit) till varje brunn. Överför 50μl extraherade FTA-kort material till varje brunn. Skaka plattan i 1 minut.
- Lägg 20μl beredd Pärlmixer (från kit) till varje prov och blanda genom att pipettera upp och ned. Skaka på bestämd hastighet i 5 minuter. RNA-molekyler binder till magnetiska kulor.
- Flytta plattan till ett magnetiskt 96-väl stå för att fånga pärlor. Beroende på vilken modell av magnetiska använda stativ kan det ta mer än 5 minuter. När lösningen har blivit helt klar, ta bort och kassera supernatanten. Ta sedan bort plattan från magnetiska monter.
- Tvätta pärlor två gånger med tvättlösning en och två gånger med tvättlösning 2 (från satsen). För varje 4 tvätta stegen lägga 150μl beredd tvätta lösning till varje prov, skaka om under en minut på bestämd hastighet, flytta plattan till den magnetiska stå, fånga pärlor i ca 5 minuter (eller tills lösningen är helt klar), ta bort och kassera supernatanten. Ta sedan bort plattan från magnetiska stå, lägga till nästa tvättlösning och utföra tvätten steg som tidigare. Efter sista tvätt, ta bort så mycket tvättlösning som möjligt och lufttorka pärlorna i rumstemperatur i plattan shaker i 2 minuter.
- Tillsätt 50μl av eluering buffert (från kit) för att frigöra RNA från kulor och skaka i 4 minuter på tallriken shaker. Fånga pärlor som tidigare beskrivits. Supernatanten innehåller nu den isolerade RNA som är redo för tillämpningar i efterföljande led.
3. RT-PCR av AIV Matrix Gene
Genomför omvänd transkription PCR (RT-PCR) med One-Step tillgång RT-PCR-system (Promega) i 25 l reaktioner (justeras från Kraus et al 18 och Fouchier et al 22..):
| Nukleasfritt fritt vatten | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 buffert 5μl | |
| dNTPs | 0.5μl |
| primer M52C 22 (10 M) | 2.5μl |
| primer M253R 22 (10 M) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 mM) | 7μl |
| AMV omvänt transkriptas (5u/μl) | 0.5μl |
| TfL polymeras (5u/μl) | 0.5μl |
| RNA-prov | 5μl |
PCR-förhållanden i ett Biometra T1 termocykler är: inledande omvänd transkription av 45 minuter vid 45 ° C, följt av 2 minuter initial denaturering vid 94 ° C och 40 cykler: 94 ° C under 1 minut, 56 ° C under 1 minut och 68 ° C i 2 minuter. En ytterligare 7 minuter töjning vid 68 ° C avslutar förstärkning.
4. Screening för AI-positiva prover och rening av Riktade fragment från gel
- Ladda 2μl av PCR-produkten blandas med 2μl 5x laddningsfärg (BioRad) och 6μl vatten på en 1% agarosgel (Roche) färgad med 1% etidiumbromid (2.5μl per 100 ml gel) för en pre-screening.
- Kör gelen i 1 timme vid 120V, tillsammans med ett DNA-storlek standard (BioRad EZ last 100 bp stege), visualisera med en gel dokumentationssystem. Se ett exempel i Figur 1.
- Välj prover med förstärkta fragment i den förväntade storleksintervallet (mellan 200 bp och 300 bp (mål fragmentet är 244 bp). Ladda hela PCR-reaktionen volym (varav ~ 23μl är kvar) av dessa kandidater med 6μl 5x laddningsfärg på en 2 % etidiumbromid färgade agarosgel och köra i 2 timmar.
- Placera gelen på en UV-transilluminator (Bioblock vetenskapliga) och inspekteras visuellt. Se ett exempel i Figur 2. Excise band av rätt storlek från gel med en skalpell placeras och i enskilda 1,5 rör ml reaktion. Rena fragment från gel, till exempel med Zymoclean Gel DNA Recovery Kit (Zymo forskning).
5. Sekvensering och identifiering av PCR-produkter
- Utför Sanger-sekvensering av målet fragment, till exempel på en ABI 3730 kapillär sequencer med ABI Big Dye 3,1 kemi (Applied Biosystems). Förbered sekvensering reaktioner i 10μl volymer med 10-20 ng gel-renat mall cDNA, 1.75μl 5x spädningsbuffert, 0.5μl Big Dye V3.1 premix, 1 l framåt grundfärg (M52C 20, 10 mm) och ddH2O. Cykling villkor: 1 min första denaturering, följt av 25 cykler: 10 s vid 96 ° C, 5 s vid 45 ° C och 4 min vid 60 ° C. Rena och förbereda sekvensering reaktionen enligt dina interna protokoll.
- Identifiera resulterar cDNA mot nukleotid databaser såsom GenBank23, t.ex. genom webbaserade verktyg som BLAST vid Nationellt centrum för bioteknik Information (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. Representativa resultat:
Gräsand (Anas platyrhynchos) Prover togs vid Ottenby fågelstation i december 2007. Från varje gräsand ett prov på FTA-kort togs som beskrivs i detta protokoll. Efter leverans, var FTA-kort förvaras i en frys vid -20 ° C i två år. Samma FTA-kort urval av laboratoriet isolera testas i Kraus et al. 18 ingick som positiv kontroll, samt nio tio gånger spädningar av det. Två negativa kontroller i) extraktion från en tomt FTA-kort, för att testa om det fanns överföring från hålslag, och ii) RT-PCR reaktion där nukleas fritt vatten användes som mall för att testa om kontaminering skett under eller i utarbetandet av PCR-reaktionen.
84 prover analyserades. En gel bild av PCR-produkter från dessa 84 prover finns i figur 1. Från naturlig prover en mängd ospecifika band kan observeras på grund av närvaron av olika mikrobiella föroreningar i avföringen. Dock är målet fragmentet av primern paret 244 bp lång. Hela PCR-reaktionen volymen av en delmängd av de prover som gav fragment i ungefär rätt storlek (mellan 200 bp och 300 bp) laddades på gelen (Figur 1). En illustration av vilka av banden klipptes från gelen finns i kompletterande figur 1. Förutom den positiva kontrollen, var två av dessa prover (69.899 och 69.912) positiva med det nya protokollet. En BLAST sökning mot NCBI nukleotid-databasen avslöjade sin identitet som AI matris-genen (Figur 3), medan alla de andra banden liknade bakteriella sekvenser närmast, eller inte ger en läsbar sekvens alls.
Figur 1. Gel bild av en preliminär screening av PCR-produkterna. 2 l PCR-produkten av den positiva kontrollen, serial spädningar av den positiva kontrollen, två negativa kontroller och 84 svabbprover prover lastades. 48 prover visas i den övre gelen panelen och 48 prover i den nedre panelen. Röda pilarna visar gel körfält för 100 bp DNA storlek standard. För illustration, röda cirklar visar banden i den förväntade storlekarna. Blå cirklar visar en ospecifik amplicon (överst till vänster) eller en primer dimer artefakt under 100 bp i storlek (nederst till höger).
Figur 2. Urvalet av prov med fragment i rätt storleksordning. Prover med band mellan 200 bp och 300 bp (mål fragment 244 BP) valdes. Den gröna pilen indikerar den positiva kontrollen, de två röda pilarna visar prover som bekräftats vara AIV positivt genom att jämföra deras cDNA till NCBI nukleotid-databasen.
Figur 3. Skärmbild av ett representativt BLAST sökning på NCBI. Var en av de cDNA erhållas från utskurna fragment undrade mot nucleotide databas på NCBI webbsida. Provet är korrekt identifieras som AI Matrix genen fragment. vill se en fullstor version av denna bild, klicka här.
Kompletterande Figur S1. Band av utvalda prover censurerade från gelen. Denna bild togs från gelen visas i Figur 1 efter kandidat-banden mellan 200 bp och 300 bp klipptes ut.
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger en kompletterande metod för att skärmen fekal eller liknande prover för förekomst av AIV. Det var särskilt utformad för att göra provtagning snabbt och enkelt. Detta gör det möjligt för mindre utbildade personer, såsom jägare eller chefer djurlivet, för att bidra till AI övervakning. Inga svala kedjor måste tillämpas, även frysa proverna rekommenderas där så är möjligt. Några dagar i rumstemperatur, till exempel under transport till laboratoriet, var inte ett problem för RNA-molekyler på FTA-kort, så länge korten förblev torrt. Andra icke-kyld lagringssystem som för närvarande utvärderas av forskarsamhället, till exempel alkohol 15 eller guanidin 16, kräver särskilda sjöfart arrangemang på grund av deras farlighet. Däremot kräver FTA-kort metoden inte frakt av farligt material. Däremot är en annan intressant lagringsmedium i detta avseende RNAlater ™ som inte är farligt heller 17. Exempel på analys kan genomföras i någon standard molekylära laboratoriet. Ingen speciell utrustning än för vanliga PCR-reaktioner och kapillär sekvensering behövdes. Alla steg skulle kunna genomföras utan ett biosäkerhetsnivån eftersom redan vid provtagning potential patogener har inaktiverat av antibakteriella och antivirala aktiviteten av frihandelsavtalet kort.
Korskontaminering och efterföljande falskt positiva prov har inte observerats i våra försök med vildfågel prover. Men när man arbetar med RNA-och PCR är det alltid klokt att ägna särskild uppmärksamhet åt ren arbetsmiljö platser och separata rum för pre-och post-PCR steg. Att arbeta i ett dragskåp minskar risken för förorening via aerosolbildning i laboratoriet. Pipettering måste utföras med filter tips.
Från en tidigare studie på prover samtidigt från samma ankor vet vi att sex av de 84 prover var positiva med den traditionella RealTime RT-PCR-metod 24 och CT värden från RealTime RT-PCR är kända. De två positiva prov upptäckts av vår metod kommer från ankor som hade Ct-värden <30 (som visar en hög koncentration av RNA). De övriga fyra prover som var positiva med den traditionella protokollet hade Ct-värden> 30 (mindre koncentrerad) och inte kunde upptäckas av våra protokoll.
Endast prover med relativt höga virus titrar var positiva i vår analys och det är sannolikt att känsligheten för metoden var källan för misslyckande att upptäcka alla positiva prover. Vidare var urvalsstorleken i den aktuella studien är mycket låga och metoden kan vara helt utvecklas och bedömas om mer kontrollerad och rigorös experimenten utförs. Men om dessa prover skulle ha samlats in från ett avlägset område, skulle traditionell analys inte varit möjligt alls. Dessutom dessa första resultaten härrör från pilotförsök som behöver ytterligare optimering. En period på två år lagring i en vanlig -20 ° C frys efter provtagning förmodligen också påverkat kvaliteten på RNA. Denna möjliga RNA nedbrytning är en viktig fråga när det handlar rumstemperatur inaktiverat virus. Prover förvaras i alternativa vätskor som nämnts ovan lider av betydande försämring som påverkar analys av längre sträckor av det virala genomet 16. Även om det inte testats i vår studie, har FTA-kort visat sig vara väl lämpade för att bevara intakt RNA-molekyler i andra RNA system som är mycket lik aviära influensavirus 25, 26.
Disclosures
Fångst, hantering och provtagning av fåglar gjordes efter nationell lagstiftning och har godkänts av den svenska Jordbruksverket och forskningen djuretik kommitté.
Acknowledgments
Vi tackar Bert Dibbits för tekniskt stöd. Den husdjursgenetik och genomik Group, Wageningen University, Nederländerna, värd generöst oss i deras laboratorium. Personalen vid Ottenby fågelstation, Sverige, tackade för att fånga och provtagning på änder, särskilt Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson och Stina Andersson. Vi tackar Sanne Svensson, Jonatan Qvist och Per-Axel Gjöres för filmning vid Ottenby och Mano Camon för filmning i labbet. Daniel Bengtson förutsatt vackra anka fotografier för videodelen av denna publikation. Ytterligare fritt material från CDC folkhälsa Image Library (PHIL, http://phil.cdc.gov/phil/ ) har använts: Elektronen mikroskop (nr 280, av Dr Erskine Palmer) och illustration (nr 11.823; av Douglas Jordanien) av influensavirus. Ekonomiskt stöd gavs av KNJV (Kungliga Nederländerna Jägareförbundet), den nederländska ministeriet för jordbruk, de Faunafonds och Stichting de Eik Trusts (båda i Nederländerna), Svenska Vetenskapsrådet (bidrag nr. 2007 till 20.774) och EG underbyggda Newflubird projektet. RNA isolering kemikalier var en generös gåva av Ambion, Inc, RNA företaget. Detta är bidrag nr 245 från Ottenby fågelstation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
- Pulido, F. The genetics and evolution of avian migration. BioScience. 57, 165-174 (2007).
- Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists. Waterbirds. 29, 243-257 (2006).
- Taubenberger, J. K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus. Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).
- Butler, D. Swine flu goes global. Nature. 458, 1082-1083 (2009).
- Normile, D. Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1. Science. 312, 1451-14 (2006).
- Si, Y. Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns. Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).
- Si, Y. Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe. Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).
- Chen, H. Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China. J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).
- Gaidet, N. Avian influenza viruses in water birds. Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).
- Krauss, S. Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange. PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).
- Parmley, E. J. Wild bird influenza survey, Canada, 2005. Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).
- Wallensten, A. Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe. Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).
- Munster, V. J. Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests. J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).
- Latorre-Margalef, N. Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks. Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).
- Runstadler, J. A. Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005. Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).
- Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces. Avian Dis. 51, 965-968 (2007).
- Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA. J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).
- Kraus, R. H. S. Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues. Wildfowl. , 215-223 (2009).
- Smith, L. M., Burgoyne, L. A. Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper. BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).
- Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA). Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).
- Rogers, C., Burgoyne, L. Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure. Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).
- Fouchier, R. A. M. Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene. J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. GenBank. Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR. J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).
- Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus. Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).
