Summary
En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.
Abstract
La capacidad de manipular la expresión génica es la piedra angular de la moderna embriología experimental, lo que lleva al esclarecimiento de múltiples vías de desarrollo. Varias tecnologías transgénicas potente y bien establecidas están disponibles para manipular los niveles de expresión de genes en el ratón, lo que permite la generación de los modelos de la pérdida y ganancia de función. Sin embargo, la generación de ratones transgénicos resulta costoso y el tiempo. Métodos alternativos de la manipulación genética han sido ampliamente tratado por lo tanto. En el útero de la electroporación es un método de entrega de genes en ratones vivos 1,2 embriones que se han adaptado con éxito 3,4. Se basa principalmente en el éxito de las tecnologías de la electroporación in ovo que se utilizan comúnmente en chica 5. En pocas palabras, el ADN es inyectado en los ventrículos abierta del cerebro en desarrollo y la aplicación de una corriente eléctrica provoca la formación de poros transitorios en las membranas celulares, lo que permite la absorción de ADN en la célula. En nuestras manos, los embriones pueden ser eficientemente electroporated a partir del día embrionario (E) 11,5, mientras que la focalización de los embriones más jóvenes que requieren una guiada por ultrasonido protocolo microinyección, como se describió anteriormente 6. Por el contrario, E15.5 es la última etapa que puede electroporar, debido a la aparición de los parietales y la diferenciación de hueso frontal, lo que dificulta la microinyección en el cerebro. Por el contrario, la retina se puede acceder a través del final de la embriogénesis. Los embriones se pueden recoger en cualquier punto durante todo el período postnatal embrionario o temprano. La inyección de un reportero construir facilita la identificación de las células transfectadas.
Hasta la fecha, en la electroporación in utero ha sido más utilizado para el análisis del desarrollo neocortical 1,2,3,4. Los estudios más recientes se han centrado en el embrión de la retina y el tálamo 7,8,9 10,11,12. A continuación, presentamos una modificación en el protocolo de electroporación in utero que puede ser fácilmente adaptada a los diferentes dominios de destino del sistema nervioso central embrionario. Aportar pruebas de que mediante el uso de esta técnica, podemos apuntar el telencéfalo diencéfalo embrionario, y la retina. Los resultados representativos se presentan, en primer lugar que muestra el uso de esta técnica para introducir las construcciones de expresión de ADN en los ventrículos laterales, lo que nos permite controlar la maduración progenitor, diferenciación y migración en el telencéfalo embrionario. También muestran que esta técnica puede ser utilizada para combatir el ADN de los territorios que rodean el ventrículo diencefálico 3 º, lo que permite las rutas migratorias de diferenciar las neuronas en los núcleos diencefálicos a ser monitoreados. Por último, se muestra que el uso de micromanipuladores nos permite introducir con precisión construcciones de ADN en las áreas objetivo pequeño, como el espacio subretiniano, lo que nos permite analizar los efectos de la manipulación de la expresión de genes en el desarrollo de la retina.
Protocol
1. Set-up
- Set-up área quirúrgica, como se muestra en la figura. 1A, A '. Los componentes clave de la puesta en marcha incluye un Eppendorf FemtoJet microinyector, micromanipulador Narishige con porta-agujas, steromicroscope Leica, sistema de iluminación por fibra óptica, sistema de ECM 830 electroporación Plaza de la onda con electrodos, una almohadilla eléctrica y un vaporizador de isoflurano anestesia.
- Limpie todas las herramientas con un limpiador ultrasónico con Bransonic Metriclean2 solución de baja espuma para ultrasonidos instrumentos quirúrgicos. Esterilizar instrumentos en autoclave. Herramientas esterilizadas luego se guardan en Germex.
- Preparar jeringas con solución salina tibia estéril y estéril solución de Ringer lactato.
2. Anestesia
- Lugar de los animales dentro de una pequeña (12cm x 20cm) cámara de anestesia. El uso de un vaporizador, entrega 5% anestésico isoflurano y oxígeno a 1L/min (Fig. 1A, A '). En particular, es importante recoger escape isoflurano mediante un sistema de depuración.
- Eliminar los animales de la cámara cuando la respiración se vuelve profunda y regular. Pellizcar los dedos y las pruebas de visión reflejo de parpadeo se utilizan para garantizar la anestesia total.
- Lugar del ratón embarazadas en su espalda en la parte superior de una almohadilla térmica (37 ° C). El cojín de la calefacción por primera vez esterilizados mediante limpieza con etanol al 70%, y luego se cubre con una esterilizada, gasa sin pelusa. Use un tubo respirador y un aparato para entregar la máscara de isoflurano (2,25%) durante la cirugía.
- Inyectar la buprenorfina (0.1mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea en la piel de la nuca.
- Monitor de animales a lo largo de la cirugía para la respiración profunda y regular. El animal no debe aliento, respirar profundamente o rápidamente. Respiración rápida y superficial puede ser un signo de la anestesia ligera, y el flujo de isoflurano debería incrementarse. Si el animal empieza a jadear, reducir el flujo de isoflurano. En el caso de un paro respiratorio, apague el isoflurano, y aumentar el flujo de oxígeno hasta el animal se recupera. Reinicie el isoflurano a una concentración menor.
3. Animal preparación para la cirugía
- Tape las extremidades anteriores del animal a la almohadilla y revisar una vez más la respuesta de retracción por pellizcar la pata trasera con una pinza roma.
- El uso de un bastoncillo de algodón estéril, extender una capa gruesa de crema depilatoria (es decir, Nair) en el abdomen. En trazos firmes, garantizar el pelaje está completamente recubierto. Dejar actuar durante una media de tres minutos, comprobando de forma intermitente con una gasa estéril limpia para eliminar el vello. Moje una gasa estéril con agua estéril y limpie el abdomen hasta que todos los restos se han ido. Repita con clorhexidina (es decir, Stanhexidine) piel más limpia y más agua. Seque el abdomen con una gasa limpia y estéril.
- Esterilizar sitio de la incisión con una solución de clorhexidina (es decir, Stanhexidine), seguida de más agua estéril. Seque el abdomen con una gasa limpia y estéril. Repita este paso con etanol al 70% y un hisopo de frescos, esterilizados de algodón.
- Colocar una gasa estéril sobre el abdomen con un corte en el medio a través del cual los cuernos uterinos se retiró durante la cirugía.
4. Incisión y exposición de cuernos uterinos
- Para exponer los cuernos uterinos, primero busque la línea alba como la tenue línea debajo de la piel en la línea media. El uso de pinzas, tire de la piel de la pared abdominal y el corte de una pequeña incisión, directamente desde el abdomen hacia abajo, a mediados de la piel con unas tijeras (aproximadamente 1 cm de longitud).
- El uso de pinzas y tijeras curvas, repita el proceso con el peritoneo.
- Coloque una gasa estéril con una pequeña incisión vertical sobre la incisión y humedecer con solución salina estéril calentada.
- Diapositivas pinza en la incisión y localizar el útero. Mantenga la incisión abierta con pinzas, mientras que la eliminación de los cuernos uterinos.
- Sujete cuidadosamente el útero entre los embriones visible primera y segunda y tire de los embriones en la gasa. Retire los dos lados de los cuernos uterinos, poniendo sobre la gasa estéril y contar el número de embriones, tomando nota de cualquier resorción o "insalubres" de los embriones (por ejemplo, un tamaño más pequeño del cuerpo). Húmedos los cuernos uterinos con solución salina y con cuidado devolver la mitad del útero en el abdomen.
5. La inyección de ADN en los ventrículos
- Las agujas quirúrgicas están preparados con un extractor Sutter Micropipetas Flaming utilizando pipetas de borosilicato con capilares (Programa: calor = 750, = 30 Tire, Vel = 90, hora = 150). Usando una hoja de bisturí estéril, la punta de la aguja suavemente afeitado en un ángulo de 45 grados.
- Para cargar la aguja, pipetas Pasteur se tira a un diámetro estrecho en una llama. La boca se adjunta a la pipeta de carga para elaborar unos 10 l de 3mg/ml libre de endotoxinas ADN mezclado con verde de metilo 0,01% (nota: verde de metilo tinte permite inyecciones de ADN para ser visualizado). La aguja llena se monta en un soporte micromanipulador y unido a la inyección FemtoJet.
- Comenzando con el embrión más cercano al ovario, circular con fórcepsse utilizan para activar suavemente el embrión dentro de la decidua por lo que se coloca "cara a seguir", permitiendo que las inyecciones que se produzca en un rostral a la dirección del caudal. Una fuente de luz de fibra óptica para la iluminación se utiliza para ayudar a visualizar la línea media del cerebro embrionario, que está flanqueada por los ventrículos laterales grandes en las regiones rostral (Fig. 1B, B ').
- El embrión se mantiene en posición con las pinzas circular. La aguja se coloca por encima del útero para que el ángulo de entrada en el cerebro es de aproximadamente 45 grados. Utilizando el micromanipulador, y un movimiento rápido y constante, la punta de la aguja se inserta a través de la pared uterina y en el ventrículo lateral del embrión. Las inyecciones se dirigen hacia los ventrículos laterales, tercero ventrículo o espacio subretiniano para apuntar el telencéfalo, diencéfalo y la retina, respectivamente. Tenga en cuenta que las vesículas cerebrales embrionarias están abiertas en las primeras etapas embrionarias de tal manera que el ADN inyectado en los ventrículos laterales fluye hacia el ventrículo 3 º.
- Presione el pedal para inyectar la endotoxina libre de ADN (1-3 l) utilizando un Eppendorf FemtoJet microinyector. Una inyección de éxito es fácil de visualizar por la difusión del colorante verde de metilo a través de los ventrículos del cerebro embrionario. La aguja se retira lentamente dibujando una copia de seguridad para evitar roturas.
6. Electroporación
- El embrión inyectado (aún dentro del útero) se coloca en la gasa estéril que cubre el abdomen de la madre y mojado a fondo con solución salina caliente. Tenga en cuenta ** La adición de solución salina a la superficie de la membrana es esencial para permitir el paso eficiente de una corriente eléctrica.
- GenePaddle electrodos se utilizan para sujetar el útero después de la inyección de ADN. Cinco pulsos cuadrados eléctrico de 40-50V y 50 ms se entregan a una velocidad de un pulso por segundo utilizando un sistema de electroporación ECM8300 BTX (Fig. 1C, C ').
- Cubrir el embrión inyectado / electroporated con una gasa húmeda de protección y continuar con el embrión que viene.
- Al término de la inyección / electroporación de todos los embriones deseada, empuje con cuidado los cuernos uterinos en el abdomen (Fig. 1D).
- Retire con cuidado el cuerno uterino y empiezan de nuevo con el embrión más cercana al ovario.
7. Sutura y grapas
- Una vez que todos los embriones están de vuelta en el interior del útero, se suman a la cavidad abdominal ~ 2.3 ml de solución salina caliente.
- Para cerrar la herida, comenzar por la eliminación de la gasa en el abdomen y la identificación de los lados del peritoneo. Comenzar la sutura del peritoneo mediante la línea de negro de seda trenzada. No se recomienda el uso de sutura absorbible para este procedimiento ya que suele ser más débil y puede dar lugar a sangrado posquirúrgico y la infección. Anclar la línea en el peritoneo cercano al esternón y proceder a punto de distancia del ancla. Asegúrese de que todas las suturas son muy ajustados, y que no hay órganos subyacentes o la piel ha sido sin querer cosido en el peritoneo. Clip de la línea de sutura restante y desechar.
- Estire la piel se cerró sobre la línea de sutura con las pinzas. Por medio de 9 mm Reflex ™ piel cierre grapas, clips de la piel sobre la herida, teniendo cuidado de no básicos por debajo de la línea de sutura, o para tirar de la piel demasiado fuerte. El método preferido es el de mantener la piel y del cuerpo con pinzas, y vienen en un ángulo de 90 grados con la herramienta de primera necesidad. Continúe hasta que la herida está cerrada (aproximadamente tres grapas). Una vez terminado, asegúrese de grapas estén bien apretados presionando suavemente con la herramienta de sutura (Fig. 1D).
8. Atención postquirúrgica
- Para supervisar la recuperación anestésica, a su vez las mujeres sobre su estómago y apagar el isoflurano. Mantener la cara del animal en el interior del aparato respiratorio, a su vez de oxígeno hasta el 3% para ayudar a la recuperación de la anestesia. El animal debe ser colocado en una gasa limpia y seca en la parte superior de la almohadilla de calefacción para evitar la hipotermia.
- Mientras el animal está aturdido, se inyectan 2 ml de solución de Ringer por vía subcutánea en la piel del cuello del animal.
- Continúe sosteniendo el animal en el flujo de oxígeno durante varios minutos y las almohadillas de gasa calentamiento con el fin de despertar a los animales. Períodos cortos de movimiento de los animales deben ser observados, ya que regresa a un patrón de respiración normal. Observar durante varios minutos hasta que los animales parece consciente y despierto.
- Rocíe el abdomen de la hembra con gentamicina spray y envolver al animal en una gasa estéril.
- Transferencia del animal en una jaula estéril con ropa de cama en autoclave y la vivienda de cartón.
- Botellas de agua deben ser limpiados, esterilizados y con agua estéril. A 500 ml de agua se añaden 2 ml de antibiótico sulfametazina (25% de acciones).
- Administrar 0,05 mg / kg por vía subcutánea de la buprenorfina después de la cirugía por la mañana.
- Monitor de la hembra cerca de las primeras 24 horas después de la cirugía. Si los animales se mantienen más de 24 horas, las mujeres se trasladan a nuevas sterile jaulas en el día 2.
9. Resultados representante
Neocórtex
El neocórtex es la región del sistema nervioso central que es responsable de visuales y el procesamiento sensorio y mayor funcionamiento cognitivo. Está compuesto por neuronas de proyección glutamatérgica y interneuronas GABAérgicas que se derivan de el telencéfalo ventral y dorsal, respectivamente. Para hacer frente a los roles de diferentes genes en el desarrollo de la neocorteza, que utilizamos en la electroporación in utero a cualquiera misexpress o bloquear la expresión (es decir, a través del uso de las construcciones shRNA) de diferentes genes en el dorsal o ventral telencéfalo 1,3,4. Para misexpress genes en el telencéfalo embrionario, se utiliza un vector de expresión bicistrónico (pCIG2), que contiene un promotor de CMV-βactin potenciador y un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES), una mayor proteína verde fluorescente (EGFP, en pCIG2) cassette, lo que permite transfectadas las células para ser detectados por epifluorescencia (Fig. 2A-C). Se utilizó esta tecnología para introducir las construcciones de expresión en el telencéfalo de E11.5 a E15.5 (datos mostrados son en E12.5;. Fig. 2). Al permitir que los embriones para desarrollar varios días después de la electroporación, que son capaces de rastrear la diferenciación y la migración de las buenas prácticas agrarias con etiqueta progenitores. A medida que avanza la diferenciación, 3 días después de la electroporación GFP + células se diferencian y migran fuera de la zona ventricular (VZ), la zona subventricular (SVZ) y zona intermedia (iz) y en la placa cortical (cp;. Fig. 2C). Si los cerebros electroporated en E12.5 se analizan después de 24 horas, podemos monitorear eventos anteriores en la maduración de progenitor y la migración neuronal por la co-etiquetado con marcadores de células progenitoras apical (es decir, Pax6;. Fig. 2A), los progenitores basal (es decir, Tbr2; . Fig. 2B) y postmitóticas neuronas neocortical (es decir, Tbr1;. Fig. 2C).
Diencéfalo
El hipotálamo está en la base ventral del sistema nervioso central y funciona como una puerta de enlace entre el sistema endocrino y el sistema nervioso autónomo. Durante el desarrollo, los múltiples núcleos que forman el hipotálamo madura diferenciarse de una zona progenitor común que las líneas de la región ventral-la mayor parte del diencéfalo embrionario. En la actualidad, las vías moleculares que regulan la proliferación de células progenitoras, la diferenciación neuronal y la formación de núcleos hipotalámicos son poco conocidos. Hemos utilizado en la electroporación in utero al objetivo de la expresión del gen de diencéfalo embrionario mediante la inyección de ADN en el ventrículo 3 º de la E12 embryos.We luego siguió la distribución de las buenas prácticas agrarias en la diferenciación de las neuronas en el E14. Con esta metodología, hemos logrado poner en la expresión de GFP en el tálamo, el pre-tálamo y el hipotálamo (Fig. 3). El análisis de las secciones coronal revela que hemos abordado con éxito la expresión de GFP en las células progenitoras que la línea de la zona ventricular del ventrículo 3 y las neuronas que migran a la zona del manto para formar núcleos (Fig. 3B)
Retina
La retina es la capa de nervios del ojo, responsable de convertir los fotones de luz en impulsos eléctricos transmitidos al cerebro. Se desarrolla como una evaginación del diencéfalo embrionario, y por lo tanto, se deriva del tubo neural. La retina neural se desarrolla a partir de un compartimento apical progenitor que se encuentra adyacente al espacio subretiniano, una cavidad que separa el ojo del mesénquima de la cabeza. Orientación construcciones de ADN de los progenitores la retina por lo que requiere que las inyecciones se realizan en un área de blanco pequeño. Utilizando micromanipuladores, hemos logrado objetivos con éxito esta pequeña área en los embriones de E13.5 a E15.5 (que se muestra es E15.5 electroporations de PCIC con el reportero mCherry; Fig. 4.). Si electroporated retinas se examinan 24 horas después de la transfección, se observa que la mayoría de las células + mCherry se encuentran en la capa exterior neuroblast (onbl), donde los progenitores se encuentran dividiendo, y no en la capa de células ganglionares de la retina (gcl; imagen insertada), donde las células postmitóticas localizar.
Figura 1. Introducción a la electroporación en el útero de configuración y metodología. (A) Los componentes clave de la cirugía de configuración incluyen un Eppendorf FemtoJet microinyector (1), micromanipulador Narishige con soporte de la aguja (2), steromicroscope Leica (3), iluminación de fibra óptica sistema (4), ECM 830 Sistema de la plaza de electroporación de onda con los electrodos (5) y el cojín de la calefacción (6). (A ') El animal se anestesia con un vaporizador de isoflurano anestesia. (B, B ') En pocas palabras, después de la anestesia, los cuernos uterinos están expuestos y el ADN mezclado con verde rápido se inyecta en el cerebro embrionario vesículas. Una inyección de éxito se visualiza mediante el seguimiento de la rápida tinte verde (B '). (C, C) Después de que el ADN es inyectado con éxito, los electrodos de paletas se colocan a ambos lados del útero, positicañoning el embrión de modo que el ADN se estira hacia el polo positivo en la región del cerebro de la elección. (D, D ') Una vez que todos los embriones son inyectados deseado, el útero es empujado hacia atrás en el abdomen (D), el peritoneo se sutura, y la piel se grapa (D'). La mujer embarazada entonces se permite la recuperación y las crías de electroporación se recogen en los puntos de tiempo deseado.
Figura 2. Ejemplo representativo de la electroporación telencefálicas dorsal. (AC) Fotomicrografía de una sección coronal a través de un telencéfalo E13.5 dorsal electroporated en E12.5 con pCIG2. Electroporated células GFP + son analizados por su expresión de marcadores de células progenitoras apical (Pax6 +, rojo, A), los progenitores basal (Tbr2 +, rojo, B) y las neuronas postmitóticas (Tbr1 +, rojo, C). cp, placa cortical; svz, zona subventricular, vz, zona ventricular.
Figura 3. Ejemplo representativo de la electroporación diencefálico. (A) Un punto de vista ventral del cerebro de un E14 que ha sido electroporated en E12 con pCIG2. GFP epifluorescencia es visible en el tálamo, el pre-tálamo y el hipotálamo, lo que demuestra la expansión de la microinyección pCIG2 plásmido en todo el ventrículo 3 º. (B) Microfotografía de la sección coronal a través del cerebro electroporación, que muestra la migración de las células GFP + fuera de la zona ventricular y en la zona del manto, donde los núcleos del hipotálamo se forma. 3V, tercer ventrículo, T, el tálamo, Hy, el hipotálamo, mz, zona del manto, Tel, telencéfalo, PreT, prethalamus; vz, zona ventricular.
Figura 4. Ejemplo representativo de la electroporación de retina. Sección coronal a través de un ojo E16.5 electroporación con PCIC en E15.5 que muestra la acumulación de células mCherry + en la capa exterior de los neuroblastos y no en Brn3b + en las células ganglionares de la retina en la capa de células ganglionares. La inserción es una imagen de mayor aumento de la zona de caja. gcl, ganglionares de la retina la capa de células, le, lentes, capa onbl, neuroblast exterior, re, la retina.
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Discussion
En el útero de la electroporación se puede utilizar para analizar una amplia variedad de procesos de desarrollo. Por ejemplo, la transfección de genes reporteros, como las buenas prácticas agrarias, mCherry o fosfatasa alcalina puede ser utilizado para llevar a cabo el linaje de búsqueda y experimentos de migración neuronal. Por otra parte, la recombinasa Cre puede ser transitoriamente expresó que la eliminación selectiva de un alelo floxed en un espacio y / o de manera temporal controlada. Además, shRNA o dominante construye negativo puede ser electroporación a la función del gen caída de destino. Finalmente, la sobreexpresión selectiva o misexpression de genes clave en el tanto de tipo salvaje y / o líneas de ratones genéticamente mutantes pueden ser utilizados para estudiar las decisiones de la celda destino. El alto rendimiento de este ensayo es fundamental ya que permite la comprobación de muchas combinaciones de factores en un tiempo muy corto. Una nota de precaución es que este procedimiento se producen cambios en la expresión génica en las células que recubren el sitio de entrada de la aguja (es decir, la respuesta de la lesión genes upregulated en la herida, según lo observado por nosotros y otros 13). Por eso se recomienda centrarse en las células por electroporación fuera de la zona de la herida. Además, las tasas de supervivencia embrionaria es baja cuando está aprendiendo esta técnica, pero rápidamente aumenta hasta> 95% con la práctica. Hasta la fecha, se han utilizado con éxito en las tecnologías de la electroporación in utero para identificar los genes regulados por proneural factores de transcripción bHLH en el telencéfalo 4. También se ha validado el uso de esta técnica para el análisis de telencefálicas elementos reguladores cis-3.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Eva Hadzimova, Mattar Pierre y Kovach Christopher por su trabajo inicial en el establecimiento en la tecnología de electroporación in utero en el laboratorio de CS. Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) subvención (44.094 MOP) y CIHR / Fundación Fighting Blindness (FFB) Nuevas equipo de Grant (00933-000) a CS y el Hospital de Niños de Alberta una beca de la Fundación de Investigación de DMK. RD fue apoyado por una beca HOPE CIHR Canadá, RC se apoya en una Beca FFB y LML fue apoyado por una beca de formación CIHR en Genética y Desarrollo Infantil.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine scissors | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Iris scissors, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Surgical Tools | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Ring forceps, 9mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Eye dressing Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Dumont #7 DMX Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont #5 DMX Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Tissue forcep-Adson | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Reflex Clip Applier | Surgical Tools | World Precision Instruments, Inc. | 500343 | |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Surgical Tools | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Autoclip Remover | Surgical Tools | Mikron | 427637 | |
| Silk Black Braided Suture | Surgical Tools | Ethicon Inc. | K871 | |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | Surgical Tools | World Precision Instruments, Inc. | 500346 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | Instruments | VWR international | 58018-004 | |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Instruments | Protech International, Inc. | CUY650P5 | |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Instruments | Protech International, Inc. | CUY650P7 | |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | Instruments | VWR international | CA62111-488 | |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | Instruments | VWR international | CAACCESS (misc.) | |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | Instruments | VWR international | CA33995-534CPN-952-118 | |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Instruments | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipettes -– Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Instruments | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Instruments | Carl Zeiss, Inc. | M-152 | |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | M1 | |
| Steel Base Plate for micromanipulator | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | 5052 | |
| Micropipette Holder | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | MPH3 | |
| Micropipette Handle | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | 5444 | |
| Stereomicroscope | Instruments | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Instruments | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Surgical Reagents | Metrex Research Corporation | 10-8100 | |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Surgical Reagents | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| Germex for sterilizing surgical tools | Surgical Reagents | Vétoquinol | DIN# 00141569 | |
| BNP ophthalmic ointment | Surgical Reagents | Vétoquinol | DIN# 00516414 | |
| Nair® | Surgical Reagents | Church & Dwight Co. | commercially available | |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Surgical Reagents | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Surgical Reagents | Merck & Co. | 531-535 | |
| Sulpha "25" sulphamethazine oral antibiotic | Surgical Reagents | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | |
| Lactated Ringer Solution | Surgical Reagents | Baxter Internationl Inc. | DIN# 0061085 | |
| Saline -– 0.9% sodium chloride | Surgical Reagents | B. Braun Medical | DIN# 01924303 | |
| Inhalation Anesthetic -– Isoflurane USP | Surgical Reagents | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN# 02237518 | |
| Fast Green FCF | Surgical Reagents | Sigma-Aldrich | F7252 |
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