Summary

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Published: June 23, 2011
doi:

Summary

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Abstract

La capacità di manipolare l'espressione genica è la pietra angolare della moderna embriologia giorno sperimentale, che porta alla spiegazione di molteplici vie di sviluppo. Diverse tecnologie potenti e ben consolidata transgenici sono a disposizione per manipolare i livelli di espressione genica nel topo, consentendo la generazione di entrambi perdita e guadagno di funzione dei modelli. Tuttavia, la generazione di topo transgenici è sia costoso e richiede tempo. Metodi alternativi di manipolazione genetica sono stati quindi ampiamente ricercato. In utero elettroporazione è un metodo di consegna del gene in embrioni di topo 1,2 vivere che abbiamo adattato con successo 3,4. È in gran parte sulla base del successo nel campo delle tecnologie di elettroporazione ovo che sono comunemente utilizzati in pulcino 5. In breve, il DNA è iniettato nei ventricoli aperto di sviluppo del cervello e l'applicazione di una corrente elettrica provoca la formazione di pori transienti nelle membrane cellulari, permettendo l'assorbimento del DNA nelle cellule. Nelle nostre mani, gli embrioni possono essere efficacemente elettroporate fin dal giorno embrionale (E) 11,5, mentre l'orientamento dei giovani embrioni richiederebbe un eco-guidata protocollo microiniezione, come descritto in precedenza 6. Al contrario, E15.5 è l'ultima tappa si può facilmente electroporate, a causa della insorgenza di differenziazione dell'osso parietale e frontale, che ostacola microiniezione nel cervello. Al contrario, la retina è accessibile fino alla fine di embriogenesi. Gli embrioni possono essere raccolti in un punto qualsiasi momento durante il periodo embrionale o postnatale precoce. L'iniezione di un costrutto giornalista facilita l'identificazione delle cellule transfettate.

Ad oggi, l'elettroporazione in utero è stata più utilizzata per l'analisi dello sviluppo neocorticale 1,2,3,4. Studi più recenti hanno preso di mira la retina embrionale 7,8,9 e 10,11,12 talamo. Qui vi presentiamo una versione modificata del protocollo di elettroporazione in utero, che può essere facilmente adattato a bersaglio diversi domini del sistema nervoso embrionale. Noi dimostrare che utilizzando questa tecnica, si può avere come bersaglio l'embrionale telencefalo, diencefalo e della retina. Risultati rappresentativi sono presentati, in primo luogo che mostra l'uso di questa tecnica per introdurre costrutti espressione del DNA nei ventricoli laterali, che ci permette di monitorare la maturazione progenitrici, la differenziazione e la migrazione nel telencefalo embrionale. Mostriamo anche che questa tecnica può essere usata per bersaglio del DNA per i territori circostanti diencefalo il 3 ° ventricolo, consentendo le rotte migratorie di differenziarsi in neuroni dei nuclei diencefalo da monitorare. Infine, abbiamo dimostrato che l'uso di micromanipolatori ci permette di introdurre con precisione i costrutti del DNA in aree bersaglio piccolo, incluso lo spazio sottoretinico, che ci permette di analizzare gli effetti della manipolazione dell'espressione genica per lo sviluppo della retina.

Protocol

1. Set-up Set-up dell'area chirurgica come mostrato in fig. 1A, A '. I componenti chiave del set-up includono un Eppendorf FemtoJet microinjector, micromanipolatore Narishige con porta aghi, steromicroscope Leica, sistema di illuminazione a fibre ottiche, Piazza del sistema ECM 830 Elettroporazione onda con gli elettrodi, piastra elettrica e un vaporizzatore per isoflurano anestetico. Pulire gli attrezzi con un pulitore ad ultrasuoni BRANSONIC utilizzando Metriclean2 soluzione a bassa formaz…

Discussion

In utero elettroporazione può essere utilizzato per analizzare una vasta gamma di processi di sviluppo. Per esempio, la trasfezione di geni reporter come GFP, mCherry o della fosfatasi alcalina può essere utilizzato per condurre esperimenti di lineage tracing e migrazione neuronale. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere transitoriamente espresso per eliminare selettivamente un allele floxed in un spazialmente e / o temporalmente modo controllato. Inoltre, shRNA o dominante costruisce negativo può es…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach per il loro lavoro iniziale per stabilire nella tecnologia di elettroporazione utero in laboratorio CS. Questo lavoro è stato finanziato da una Canadian Institute of Health Research (CIHR) sovvenzioni (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging squadra di Grant (00933-000) per CS e bambini Alberta Hospital Research Foundation Grant a DMK. RD è stato sostenuto da una borsa di studio CIHR Speranza Canada, RC è supportato da un Studentship FFB e LML è stato sostenuto da una borsa di formazione CIHR in Genetica e sviluppo del bambino.

Materials

Name of reagent Company Catalogue Number Category
Fine scissors Fine Science Tools Inc. 14078-10 Surgical Tools
Iris scissors, curved Fine Science Tools Inc. 14061-10 Surgical Tools
Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder Fine Science Tools Inc. 12002-12 Surgical Tools
Ring forceps, 9mm Fine Science Tools Inc. 11103-09 Surgical Tools
Eye dressing Forcep Fine Science Tools Inc. 11051-10 Surgical Tools
Dumont #7 DMX Forcep Fine Science Tools Inc. 11271-30 Surgical Tools
Dumont #5 DMX Forcep Fine Science Tools Inc. 11251-30 Surgical Tools
Tissue forcep-Adson Fine Science Tools Inc. 11027-12 Surgical Tools
Reflex Clip Applier World Precision Instrument 500343 Surgical Tools
Perforated Spoon, 15 mm diameter Fine Science Tools Inc. 10370-18 Surgical Tools
Autoclip Remover Mikron 427637 Surgical Tools
Silk Black Braided Suture Ethicon Inc. K871 Surgical Tools
Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips World Precision Instruments 500346 Surgical Tools
ECM 830 Square Wave Electroporation System VWR-CanLab 58018-004 Instruments
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode Protech International Inc. CUY650P5 Instruments
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode Protech International Inc. CUY650P7 Instruments
Eppendorf Femtojet Microinjector VWR CanLab CA62111-488 Instruments
Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector VWR CanLab CAACCESS (misc.) Instruments
Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH VWR CanLab CA33995-534 CPN-952-118 Instruments
Sutter P97 Micropipet Puller Sutter Instrument, Carsen Group Inc. P-97 Instruments
Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length Sutter Instrument BF100-78-10 Instruments
3-Axis Coarse Manipulator Carl Zeiss Canada Inc. M-152 Instruments
Magnetic Holding Device for micromanipulator World Precision Instruments M1 Instruments
Steel Base Plate for micromanipulator World Precision Instruments 5052 Instruments
Micropipette Holder World Precision Instruments MPH3 Instruments
Micropipette Handle World Precision Instruments 5444 Instruments
Stereomicroscope Leica MZ6 Instruments
Vaporizer for isoflurane anesthetic Porter Instruments Company MODEL 100-F Instruments
Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools Metrex Research Corporation 10-8100 Surgical Reagents
Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing Sigma Aldrich G1264 Surgical Reagents
Germex for sterilizing surgical tools Vétoquinol DIN# 00141569 Surgical Reagents
BNP ophthalmic ointment Vétoquinol DIN# 00516414 Surgical Reagents
Nair® Distributed by Church & Dwight Co., Inc. commercially available Surgical Reagents
Stanhexidine 4% w/v skin cleaner Omega Laboratories Inc. 01938983 Surgical Reagents
Buprenorphine (Temgesic) analgesic Schering-Plough 531-535 Surgical Reagents
Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic Professional Veterinary Laboratories DIN# 00308218 Surgical Reagents
Lactated Ringer Solution Baxter Corporation DIN# 0061085 Surgical Reagents
Saline – 0.9% sodium chloride B-Braun Medical Inc. DIN# 01924303 Surgical Reagents
Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP Pharmaceutical Partners of Canada Inc. DIN# 02237518 Surgical Reagents
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Surgical Reagents

References

  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  2. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
  3. Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
  4. Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
  5. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
  6. Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
  8. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
  9. Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
  10. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  11. Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  12. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
  13. Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).

Play Video

Cite This Article
Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M., Schuurmans, C. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957, doi:10.3791/2957 (2011).

View Video