Summary

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l'aide In Utero L'électroporation

Published: June 23, 2011
doi:

Summary

Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d'expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.

Abstract

La capacité de manipuler l'expression des gènes est la pierre angulaire de la journée embryologie moderne expérimentale, ce qui conduit à l'élucidation des multiples voies de développement. Plusieurs puissants et bien établis technologies transgéniques sont disponibles pour manipuler les niveaux de l'expression des gènes chez la souris, permettant la génération des deux perte et le gain de fonction des modèles. Cependant, la génération de souris transgéniques est à la fois coûteux et fastidieux. D'autres méthodes de manipulation génétique ont donc été largement sollicités. In utero électroporation est une méthode de transfert de gènes dans les embryons de souris 1,2 que nous avons réussi à adapter 3,4 vivre. Il est largement basé sur le succès de l'électroporation in ovo dans les technologies qui sont couramment utilisés dans chiches 5. Brièvement, l'ADN est injecté dans les ventricules du cerveau ouverte développement et l'application d'un courant électrique provoque la formation de pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant l'absorption de l'ADN dans la cellule. Dans nos mains, les embryons peuvent être efficacement électroporées dès le jour embryonnaire (E) 11,5, tandis que le ciblage des jeunes embryons exigerait une guidée par échographie protocole de micro-injection, comme décrit précédemment 6. Inversement, E15.5 est la dernière étape, nous pouvons facilement électroporation, en raison de l'apparition de la pariétale et la différenciation des os frontal, ce qui entrave la microinjection dans le cerveau. En revanche, la rétine est accessible par la fin de l'embryogenèse. Les embryons peuvent être recueillies à aucun moment pendant toute la période embryonnaire ou postnatale précoce. L'injection d'un journaliste de la construction facilite l'identification des cellules transfectées.

À ce jour, électroporation in utero a été plus largement utilisé pour l'analyse du développement du néocortex 1,2,3,4. Des études plus récentes ont ciblé la rétine et le thalamus embryonnaire 7,8,9 10,11,12. Ici, nous présentons une modification dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être facilement adaptée pour cibler les différents domaines du système nerveux central embryonnaire. Nous fournir la preuve que en utilisant cette technique, nous pouvons cibler le télencéphale embryonnaire, diencéphale et la rétine. Les résultats représentatifs sont présentés, montrant d'abord l'utilisation de cette technique pour introduire des constructions d'expression d'ADN dans les ventricules latéraux, nous permettant de suivre la maturation progénitrices, la différenciation et la migration dans le télencéphale embryonnaire. Nous montrons également que cette technique peut être utilisée pour cibler l'ADN dans les territoires environnants diencéphalique le ventricule 3 ème, permettant les routes migratoires de différencier les neurones en noyaux diencéphalique à surveiller. Enfin, nous montrons que l'utilisation de micromanipulateurs nous permet d'introduire précisément constructions d'ADN dans les zones cibles légères, y compris l'espace sous-rétinien, nous permettant d'analyser les effets de la manipulation de l'expression des gènes sur le développement de la rétine.

Protocol

1. Mise en place Set-up zone chirurgicale, comme indiqué dans la Fig. 1A, A '. Les éléments clés de la mise en place comprennent une Eppendorf FemtoJet microinjecteur, micromanipulateur Narishige avec porte-aiguille, steromicroscope Leica, système d'éclairage à fibres optiques, ECM 830 Système Place électroporation vague avec des électrodes, un coussin chauffant et d'un vaporisateur pour l'isoflurane anesthésique. Nettoyer tous les outils avec un nettoyeur à ultrasons à …

Discussion

In utero électroporation peut être utilisée pour analyser une grande variété de processus de développement. Par exemple, la transfection de gènes rapporteurs tels que la GFP, mCherry ou la phosphatase alcaline peut être utilisé pour effectuer le traçage et la lignée des expériences de la migration neuronale. Alternativement, la recombinase Cre peut être transitoirement exprimé d'éliminer sélectivement un allèle floxés dans un espace et / ou temporellement contrôlée manière. Par ailleurs…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Eva Hadzimova, Pierre Mattar et Christopher Kovach pour leur travail initial dans l'établissement en matière de technologie d'électroporation in utero dans le laboratoire de CS. Ce travail a été financé par un Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC) subvention (44 094 MOP) et Fighting Blindness IRSC / Fondation (FFB) Subvention d'équipe émergente (00933-000) pour CS et une enfance de l'Alberta Hospital Research Foundation Grant à DMK. RD a été soutenue par une bourse des IRSC Hope Canada, RC est soutenu par une bourse d'études FFB et LML a été soutenu par une subvention de formation des IRSC en génétique et développement de l'enfant.

Materials

Name of reagent Company Catalogue Number Category
Fine scissors Fine Science Tools Inc. 14078-10 Surgical Tools
Iris scissors, curved Fine Science Tools Inc. 14061-10 Surgical Tools
Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder Fine Science Tools Inc. 12002-12 Surgical Tools
Ring forceps, 9mm Fine Science Tools Inc. 11103-09 Surgical Tools
Eye dressing Forcep Fine Science Tools Inc. 11051-10 Surgical Tools
Dumont #7 DMX Forcep Fine Science Tools Inc. 11271-30 Surgical Tools
Dumont #5 DMX Forcep Fine Science Tools Inc. 11251-30 Surgical Tools
Tissue forcep-Adson Fine Science Tools Inc. 11027-12 Surgical Tools
Reflex Clip Applier World Precision Instrument 500343 Surgical Tools
Perforated Spoon, 15 mm diameter Fine Science Tools Inc. 10370-18 Surgical Tools
Autoclip Remover Mikron 427637 Surgical Tools
Silk Black Braided Suture Ethicon Inc. K871 Surgical Tools
Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips World Precision Instruments 500346 Surgical Tools
ECM 830 Square Wave Electroporation System VWR-CanLab 58018-004 Instruments
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode Protech International Inc. CUY650P5 Instruments
Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode Protech International Inc. CUY650P7 Instruments
Eppendorf Femtojet Microinjector VWR CanLab CA62111-488 Instruments
Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector VWR CanLab CAACCESS (misc.) Instruments
Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH VWR CanLab CA33995-534 CPN-952-118 Instruments
Sutter P97 Micropipet Puller Sutter Instrument, Carsen Group Inc. P-97 Instruments
Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length Sutter Instrument BF100-78-10 Instruments
3-Axis Coarse Manipulator Carl Zeiss Canada Inc. M-152 Instruments
Magnetic Holding Device for micromanipulator World Precision Instruments M1 Instruments
Steel Base Plate for micromanipulator World Precision Instruments 5052 Instruments
Micropipette Holder World Precision Instruments MPH3 Instruments
Micropipette Handle World Precision Instruments 5444 Instruments
Stereomicroscope Leica MZ6 Instruments
Vaporizer for isoflurane anesthetic Porter Instruments Company MODEL 100-F Instruments
Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools Metrex Research Corporation 10-8100 Surgical Reagents
Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing Sigma Aldrich G1264 Surgical Reagents
Germex for sterilizing surgical tools Vétoquinol DIN# 00141569 Surgical Reagents
BNP ophthalmic ointment Vétoquinol DIN# 00516414 Surgical Reagents
Nair® Distributed by Church & Dwight Co., Inc. commercially available Surgical Reagents
Stanhexidine 4% w/v skin cleaner Omega Laboratories Inc. 01938983 Surgical Reagents
Buprenorphine (Temgesic) analgesic Schering-Plough 531-535 Surgical Reagents
Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic Professional Veterinary Laboratories DIN# 00308218 Surgical Reagents
Lactated Ringer Solution Baxter Corporation DIN# 0061085 Surgical Reagents
Saline – 0.9% sodium chloride B-Braun Medical Inc. DIN# 01924303 Surgical Reagents
Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP Pharmaceutical Partners of Canada Inc. DIN# 02237518 Surgical Reagents
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Surgical Reagents

References

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Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M., Schuurmans, C. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957, doi:10.3791/2957 (2011).

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