Summary
В этой статье мы представляем простые, практические методики цереброваскулярных литья, которые легко выполнить, и может быть использован для изображения сосудистого дерева взрослом мозге мыши.
Abstract
Сосудистая визуализация имеет решающее значение для клинической диагностики и лечения цереброваскулярных заболеваний, таких как мозг артериовенозных мальформаций (BAVMs). Животные модели необходимы для изучения etiopathology и потенциальных терапии цереброваскулярных заболеваний. Изображениями сосудистую у крупных животных сравнительно легко. Вместе с тем развивающиеся судна изображений методами мышиной модели заболевания головного мозга, желательно из-за стоимости и наличия генетически-модифицированные линии мышей. Изображениями мышиной мозговых сосудов дерево является непростой задачей. В организме человека и крупных животных, золотой стандарт для оценки angioarchitecture на макро-(проводимость) уровень рентгеновского катетер отличие основе ангиографии, метод не подходит для мелких грызунов.
В этой статье мы представляем метод мозгового литье, которое производит прочный скелет всего сосудистого русла, в том числе артерий, вен и капилляров, которые могут быть проанализированы с помощью многих дifferent модальностей. Полное литья микрососудов мыши cerebrovasculature может быть трудно, однако, эти проблемы решаются в этом шаг за шагом протокола. Через intracardial перфузии сосудистого материала литье, все суда теле отлиты. Мозг может быть удален и уточнить использованием органических растворителей метилсалицилат. Трехмерная визуализация сосудов головного мозга кровью могут быть визуализированы просто и недорого с любой обычный микроскоп светлого или рассекает микроскопом. Литой cerebrovasculature может также быть отображены и количественно с использованием микро-компьютерная томография (КТ микро-) 1. Кроме того, после того, отображаемого, литой мозг может быть встроен в парафин для гистологического анализа.
Преимущество этого метода литья сосудистой по сравнению с другими методами является ее широкая адаптация к различным аналитическим инструментам, включая светлое микроскопический анализ, КТ-за рентгеноконтрастные характеристикиХарактерные материала, а также гистологического и иммуногистохимического анализа. Это эффективное использование тканей может спасти животное использования и снижения затрат. Недавно мы продемонстрировали применение этого метода для визуализации нерегулярные кровеносных сосудов в мышиной модели взрослого BAVM на микроскопическом уровне 2, и предоставить дополнительные изображения неправильный суда изображено микро-КТ. Хотя этот метод имеет свои недостатки и не может быть идеальным для всех видов анализов, это простой и практичный метод, который может быть легко изучена и широко применяется для литья сосудистой кровеносных сосудов по всему телу.
Protocol
1. Очистка крови с сосудистой
- Анестезию мыши, при введении препарата в дозе 100 мг / кг кетамина с 10 мг / кг ксилазина разводят в 0,25 мл физиологического раствора.
- После анестезии было подтверждено отсутствие ответа на лапу крайнем случае, используйте ножницы, чтобы сделать разрез на груди с помощью ножниц чуть ниже xyphoid процесса, прорезать диафрагмы и разрезать между спинной и брюшной части грудной клетки, чтобы разоблачить грудной полости. Expose сердце, складывая грудины и смежных грудной стенки и закрепите кровоостанавливающего. Открытое перикард с помощью пинцета, чтобы разоблачить сердце.
- Включите перфузионного насоса (100mmHg давление), подключенных к теплым PBS плюс гепарин (5 ед / мл) раствор в ванну с горячей водой при температуре 37 ° С, а трубка с тупой иглой 22 калибра на отток.
- Вставьте иглу в левый желудочек, у верхушки сердца. Сразу же разрезать правое предсердие включить системный отток крови и продолжайте промывку до крови яс изъяты из оборота.
2. Перфузии агент по кастингу в сосудистой системы
- Подготовка Microfil (Flow Tech, Inc Карвер, MA) литье решение в соответствии с протоколом производителя: смешать 5 мл растворителя М. В. с 4 мл фильтрованного М. В. соединения. Добавить 450μl (5%) катализатора (М. В. отвердителя). Решение рабочего времени составляет 20 минут, но смешивать непосредственно перед применением, чтобы обеспечить надлежащую вязкость.
- Вывод агент по кастингу раствора в 10 мл шприц, приложите тупой иглой 20 калибра, чтобы шприц и иглу заполнить раствором.
- Вставьте иглу в левый желудочек через те же отверстия используются для промывки крови. Безопасные иглу в место с кровоостанавливающего зажима на сердце.
- Inject решение агент по кастингу медленно в левом желудочке примерно в 3 мл / мин. Избыточное давление может привести к неправильным потоком агент по кастингу или потенциального разрыва сосуда.
- Ищите признаки успешного перфузии, в том числе: визуализация литойING агента в кишечнике и печени, сосудистой, дистальный обесцвечивание конечностей, а нос и язык цвета. Отрегулируйте иглы при необходимости для достижения надлежащего перфузии.
3. Сбор и обработка тканей
- Удалить мозга и место в 4% параформальдегида ночи при 4 ° C.
- Дегидрировать мозга путем размещения от параформальдегида прямо в большей степени концентрируется этанола при комнатной температуре: 25% этанола, 1 день, 50% этанола, 1 день, 75% этанола, 1 день, 95% этанола, 2 дней, и 100% этанолом, 2 дня .
- Уточнить мозговой ткани вокруг кровеносных сосудов путем погружения перфузии мозга в метилсалицилат в течение 2 дней при комнатной температуре.
- Сосудистую всего unsectioned уточнил мозг может быть, полученную с использованием мозга погружены в метилсалицилат при вскрытии микроскопа (рис. 1) (Leica MZFL III микроскоп, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) или светлое микроскопа (рис. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
- Reclarificationможно сделать, если ткани не полностью очищен. С метилсалицилат, передача мозга до 95% этанола в течение 2 дней, 100% этанола в течение 2 дней, и метилсалицилат на 2 дня.
4. Микро-КТ или Гистологическое приложений подготовки ткани
- Мозг может быть отображены с использованием микро-КТ непосредственно после разъяснений или после повторной гидратации (рис. 4).
- Для подготовки мозговой ткани для гистологического анализа, увлажняет мозг через последовательный разбавленного этанола: 100% этанола, 1 день, 95% этанола, 1 день, 75% этанола, 1 день, 50% этанола, 2 дня, 25% этанола, 2 дня ; и хранить в PBS. Мозг может быть в парафин использованием стандартной процедурой.
5. Представитель Результаты
После сосудистых литье, cerebrovasculature видно макроскопически на поверхности мозга (рис. 1а). Сосудистого дерева внутри паренхимы могут быть визуализированы следующее разъяснение (рис. 1б). Подробное сосудистой структурымогут быть отображены и проанализированы под микроскопом светлое (рис. 2), рассекая область (рис. 3), а с микро-КТ (рис. 4). Использование светлого микроскопии, сосудистую можно рассматривать в разных фокальных плоскостях без срезов головного мозга (рис. 2), а также отдельных микрососудов при большем увеличении (рис. 2В). Под рассекает сферу, можно увидеть весь сосудистые структуры в одной фокальной плоскости, что позволяет лучше визуализировать трехмерные структуры cerebrovasculature (рис. 3). Изображения, полученные при вскрытии микроскоп может показать большие морфологии судно и весь сосудистой мозга, но отсутствие подробностей показано на фотографии, полученной с светлого микроскопии (рис. 2В). Этот метод позволил нам обнаружить нерегулярные судов в наших экспериментальных BAVM взрослых мышах 2. Рисунок 5 показывает пример того же нерегулярные судов обнаружены микро-КТ (рис. 5а) и светлое микроскопа (рис. 5б). Вместе, эти данные показывают, что мы можем проанализировать тон же образца с несколькими инструментами визуализации после сосудистой литья.
Рисунок 1. Весь мозг мыши следующий сосудистой литья. До () и после (б) разъяснение метилсалицилат растворителя. Суда могут быть четко визуализируется на поверхности мозга (А) и в паренхиме следующую процедуру уточнения (B).
Рисунок 2. Светлое микроскопом образы уточнил сосудистой литой мозга. Мозг может быть отображены в различных плоскостях и на разных уровнях увеличения. Шкала Бар 200 мкм (А) и 50 мкм (Б).
Рисунок 3. Пройдя через микроскоп изображение со скоростью 1x показывающие весь мозг взрослой мыши cerebrovasculature от спинной стороны.
<IMG ALT = "Рисунок 4" SRC = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" />
Рисунок 4. Микро-КТ изображений одного и того же весь мозг мыши взрослых показано на Рисунке 3 из спинной стороны.
Рисунок 5. Применение сосудистых литья для выявления артериовенозной мальформации мозга. ) Микро-КТ сосудистых литой мозга показывает области увеличены, нерегулярные АВМ-подобных судов в правом полушарии с брюшной стороны. Увеличенное изображение области (белая коробка) показан справа. Б) То же нерегулярные суда визуализируются под микроскопом на светлое 50x увеличением. Шкала бар 50 мкм.
Discussion
Мы сообщаем здесь методом литья взрослых cerebrovasculature мыши, которые могут быть отображены с различными условиями. Применение этого метода к BAVM модели болезни 3D дает возможность анализа нерегулярных судов. Потенциальные будущие исследования включают количественного микро-КТ изображений, гистологический анализ ткани, и диагностика сосудистых прогрессирования заболевания.
Общие проблемы и предложения
Полное перфузии головного мозга сосудистой не всегда достигается. Имея достаточно давления, чтобы достичь дистальных сосудов без разрыва левого предсердия или аорты является непростой задачей. Чтобы преодолеть это, применить последовательное давление около 100mmHg. Также отрегулируйте положение иглы для обеспечения надлежащего отток агент по кастингу в аорту. Важно, чтобы сонных артерий не ограничены таким образом агент по кастингу может достигать сосудов головного мозга. Критические процедур, которые коррелируют с улучшением небольшое судно вслияния являются: (1) надлежащим очистки крови от сосудистой, (2) фильтрации агент по кастингу, и (3) иглы во время литья агент инъекции. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать введения агент по кастингу в левое предсердие и легких. Другие исследователи успешно перфузии мыши и крысы 3 4 cerebrovasculature без использования дополнительных процедур. Руководство анализ Microfil перфузии суда контрастно с hemotoxylin показал 93% просвет сосуда перфузии 5. Всегда отказаться или полностью очистить любой инструмент, который вступает в контакт с агент по кастингу, как она будет полимеризоваться быстро, и средства не могут использоваться для различных предметов. Разъяснение окружающие ткани мозга мыши может быть сложной задачей. После погружения в метилсалицилат, ткань может появиться, непрозрачной, что делает судно изображений трудно. Обеспечение надлежащего обезвоживания и разъяснения должны решить эту проблему. Размещение мозговой ткани на рокер во время алкоголь и метил-овalicylate лечение может улучшить ткани разъяснения.
Недостатки техники
Ограничения этого метода относятся: (1) необходимо внедрить решение агент по кастингу сразу после смешивания это, поскольку это будет сгущаться вскоре после того, катализатор добавляется, (2) литье агент заполняет крупные сосуды проводимость легко, но это не надежно заполнения небольших судов, таких как артериол (сопротивление сосудов) и капилляров (питательную судов); и (3) это не самый лучший рентгеноконтрастные контраст для микро-КТ, хотя некоторые группы предпочитают Microfil для микро-КТ 1,6. Однако после предложения предложенные выше, в том числе правильное размещение иглы, местоположении судна и перфузионного давления, полной литья мелких судов могут быть достигнуты. Адаптируемость к различным инструментам анализа делает этот препарат ценный инструмент для анализа мозговых структуры, в том числе артериального и венозного кровообращения, с различнымиперспективы.
Применение техники
Преимуществом этого метода является его широкие возможности применения. Литой заполняет все суда, в том числе артерий, вен и капилляров всех тканей в организме, так сосудистых структур в различных органах различных видов могут быть проанализированы. Ранее другие группы использовали эту перфузии для больших и малых 7 8 судов в организме человека, обезьяны 9, 10 овец, крыс 4,11,12 и мыши 3,13. Покажем теперь, доказательств использования этого метода при анализе структуры микрососудов в мозг мыши, как у здоровых и больных состояний 2. Кроме того, Есть Microfil решений с различной вязкости доступны для заливать судов различных размеров и разных цветов для улучшения визуализации сосудов в различных органах. Например, красный может быть легко визуализированы в бледно паренхимы мозга, и желтый контрастирует стемно-красный миокарда. Более того, как материал рентгеноконтрастные, сосудистую может быть, полученную с использованием микро-КТ-сканирование для получения 3D вращающиеся изображения. Ткани могут также использоваться для парафиновых срезов и гистологический анализ после того, как образ.
Заключение
Мы демонстрируем здесь протокол, чтобы сделать сосудистой бросок кровеносных сосудов взрослого мозга мыши, которые могут быть адаптированы с использованием различных методов анализа для изучения морфологического строения cerebrovasculature. Мы также представили доказательства для применения этого метода к модели государства, болезнь BAVM, в лице увеличены, неправильной формы сосудов, шунт крови из артериальной в венозную тиражами. Существуют различные методы литья сосудистой доступны. Простой протокол мы предоставляем здесь сосудистой литых могут быть использованы в качестве инструмента для изучения сосудистой о взрослом мозге мыши, используя различные методы визуализации.
Disclosures
Экспериментальные процедуры с использованием лабораторных животных были утверждены по Уходу за животными и использованию комитетом Университета Калифорнии, Сан-Франциско (UCSF).
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Вольтер Gungab за помощь в подготовке рукописи. Эта работа была частично поддержана грантами от: Национального института здоровья (T32 GM008440 к EJ Уокер, R01 NS27713 к WL Янг, P01 NS44155 к WL Молодые и Х. Су), а R21 NS070153 к Н. Су, и американский Ассоциация Сердца (AHA 10GRNT3130004 к Н. Су).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
References
- Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs. Bone. 43, 195-202 (2008).
- Walker, E. J. Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease. Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).
- Iqbal, U. Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).
- Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat. 145, 473-480 (2003).
- Chugh, B. P. Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography. Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. ainey, L, L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).
- Fossett, D. T., Caputy, A. J. Operative Neurosurgical Anatomy. , Thieme Medical Publishers. New York. (2002).
- Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta). Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).
- Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).
- Brady, J. M., Cutright, D. E. A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat. Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).
- Evan, A. P., Dail, W. G. Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney. Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
