Summary
En este artículo presentamos una técnica sencilla y práctica para la fundición cerebrovascular que es fácil de realizar y pueden ser utilizados para obtener imágenes del árbol vascular del cerebro del ratón adulto.
Abstract
Vascular imagen es crucial en el diagnóstico clínico y el tratamiento de las enfermedades cerebrovasculares, tales como las malformaciones arteriovenosas cerebrales (BAVMs). Los modelos animales son necesarios para el estudio de la etiopatogenia y el potencial de las terapias de las enfermedades cerebrovasculares. Imágenes de la vasculatura en animales grandes es relativamente fácil. Sin embargo, el desarrollo de métodos de imagen buque de modelos murinos de enfermedades cerebrales es deseable debido al coste y la disponibilidad de líneas de ratones modificados genéticamente. Imágenes de la murino árbol vascular cerebral es un reto. En los seres humanos y animales de mayor tamaño, el estándar de oro para evaluar la angioarquitectura en el macrovascular (conductancia) es el nivel de rayos X del catéter de contraste basado en la angiografía, un método no es adecuado para pequeños roedores.
En este artículo, presentamos un método de fundición cerebrovascular que produce un esqueleto resistente del lecho vascular completo, incluyendo las arterias, venas y capilares que pueden ser analizados usando muchos dmodalidades ifferent. Fundición completa de los microvasos de la cerebrovasculature ratón puede ser difícil, sin embargo, estos desafíos se abordan en este protocolo paso a paso. A través de la perfusión intracardíaca del material de fundición vascular, todos los vasos del cuerpo están fundidas. Entonces, el cerebro se puede quitar y aclarado con el salicilato de metilo orgánico solvente. Imágenes tridimensionales de los vasos sanguíneos del cerebro se puede visualizar sencilla y económica con cualquier microscopio de campo claro convencional o un microscopio de disección. El cerebrovasculature fundido también se pueden visualizar y cuantificar el uso de micro-tomografía computarizada (micro-CT) 1. Además, después de haber sido fotografiado, el cerebro fundido puede ser embebido en parafina para su análisis histológico.
La ventaja de este método de fundición vascular en comparación con otras técnicas es su amplia adaptación a diversas herramientas de análisis, incluyendo el análisis de campo claro microscópica, la TC debido a las características radiopacaspropias de la materia, así como el análisis histológico e inmunohistoquímico. Este uso eficiente de los tejidos puede salvar el uso de los animales y reducir los costos. Recientemente hemos demostrado la aplicación de este método para visualizar los vasos sanguíneos irregulares en un modelo murino de BAVM adultos a nivel microscópico 2, y ofrecer más imágenes de los vasos malformados fotografiada por micro-TAC. Aunque este método tiene sus inconvenientes y no puede ser ideal para todo tipo de análisis, es una técnica sencilla, práctica que puede ser fácilmente aprendido y aplicado ampliamente a la fundición vascular de los vasos sanguíneos en todo el cuerpo.
Protocol
1. Limpieza de sangre de la vasculatura
- Anestesiar a ratones mediante la inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina con 10 mg / kg de xilazina diluida en solución salina 0,25 ml.
- Una vez que la anestesia ha sido confirmado por no responder a una pizca de la pata, utilizar tijeras para hacer una incisión en el pecho con unas tijeras justo debajo de la apófisis xifoides, corte a través del diafragma, y cortada entre el segmento dorsal y ventral de la caja torácica para exponer la cavidad torácica. Exponer el corazón doblando el esternón y la pared torácica adyacente y seguro con pinzas hemostáticas. Abrir el saco pericárdico con pinzas para exponer el corazón.
- Encienda la bomba de perfusión (100 mmHg de presión) conectado a PBS caliente más heparina (5 unidades / ml) en un baño de agua caliente a 37 ° C y el tubo con una aguja de calibre 22 en la contundente salida.
- Insertar la aguja en el ventrículo izquierdo, cerca del ápice del corazón. Inmediatamente abrieron la aurícula derecha para permitir flujo arterial sistémica y continuar el lavado hasta la sangre is retiró de la circulación.
2. La perfusión de agente de casting en el sistema vascular
- Prepare Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) solución de fundición por el protocolo del fabricante: Mezclar 5 ml de diluyente MV con 4 ml de compuesto MV filtrado. Agregar 450μl (5%) de catalizador (MV agente de curado). Tiempo de solución de trabajo es de 20 minutos, pero la mezcla inmediatamente antes de su uso para asegurar la viscosidad adecuada.
- Retirar de fundición solución del agente en una jeringa de 10 ml, adjuntar un contundente 20 aguja a la jeringa y la aguja de llenado con la solución.
- Insertar la aguja en el ventrículo izquierdo a través del mismo agujero utilizado para la irrigación de la sangre. Aguja asegura en su lugar con la pinza hemostática en el corazón.
- Inyectar la solución de fundición agente lentamente hacia el ventrículo izquierdo a aproximadamente 3 ml / min. El exceso de presión puede conducir a un flujo incorrecto de agente de casting o de ruptura de los vasos potencial.
- Busque signos de perfusión con éxito, incluyendo: Visualización del repartoción del agente en la vasculatura intestino y el hígado, decoloración de la extremidad distal, y la nariz y la decoloración de la lengua. Reajustar la aguja, si es necesario para lograr una perfusión adecuada.
3. Recolección y procesamiento de tejidos
- Quitar el cerebro y el lugar en paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C.
- Deshidratar el cerebro mediante la colocación de paraformaldehído directamente en EtOH concentra cada vez más a temperatura ambiente: 25% EtOH, 1 día, 50% de EtOH, 1 día, 75% de EtOH, un día, y el 95% de EtOH, 2 días, y el 100% EtOH, 2 días .
- Aclarar el tejido cerebral alrededor de los vasos sanguíneos del cerebro mediante la inmersión de perfusión en salicilato de metilo durante 2 días a temperatura ambiente.
- Vasos sanguíneos de todo el cerebro unsectioned aclarado se pueden visualizar con el cerebro inmerso en salicilato de metilo bajo un microscopio de disección (Fig. 1) (Leica MZFL microscopio III, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) o microscopio de campo claro (Fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
- Reclarificationse puede hacer si el tejido no esté completamente curada. Del cerebro de la transferencia de salicilato de metilo, el 95% de EtOH durante 2 días, 100% EtOH durante 2 días, y salicilato de metilo durante 2 días.
4. Micro-TC o la preparación histológica de aplicación de tejidos
- El cerebro se pueden visualizar mediante micro-CT directamente después de la aclaración o después de la re-hidratación (Fig. 4).
- Para preparar el tejido cerebral para el análisis histológico, rehidratar el cerebro a través de EtOH diluida en serie: EtOH al 100%, un día, y el 95% de EtOH, 1 día, 75% de EtOH, 1 día, 50% de EtOH, 2 días, 25% de EtOH, 2 días y almacenar en PBS. El cerebro entonces puede ser embebido en parafina utilizando un procedimiento estándar.
5. Resultados representante
Después de fundición vascular, la cerebrovasculature se puede ver macroscópicamente en la superficie del cerebro (Fig. 1A). Del árbol vascular en el interior del parénquima se puede visualizar la siguiente aclaración (Fig. 1B). La estructura vascular detalladapueden ser reflejados y analizados bajo un microscopio de campo claro (Fig. 2), la disección de alcance (Fig. 3), y con micro-TC (Fig. 4). Mediante microscopía de campo claro, los vasos se pueden ver en diferentes planos focales sin seccionar el cerebro (Fig. 2A), así como microvasos individuales a mayores aumentos (Fig. 2B). Bajo un microscopio de disección, se puede ver toda la estructura vascular en un plano focal, lo que permite una mejor visualización de la estructura tridimensional de la cerebrovasculature (Fig. 3). Las imágenes tomadas con un microscopio de disección puede mostrar la morfología de los vasos grandes y vasos de todo el cerebro, pero carecen de los datos que aparecen en las imágenes tomadas con el microscopio de campo claro (Fig. 2B). Esta técnica nos ha permitido detectar embarcaciones irregulares en nuestro modelo de ratón experimental BAVM adulto 2. La Figura 5 muestra un ejemplo de las mismas embarcaciones irregulares detectados por micro-TC (Fig. 5) y el microscopio de campo claro (Fig. 5B). En conjunto, estos datos muestran que se puede analizar tque muestra lo mismo con las herramientas de imágenes múltiples después de la fundición vascular.
Figura 1. Cerebro de ratón toda la nueva fundición vascular. Antes (A) y después (B) la clarificación salicilato de metilo solvente. Los buques pueden ser claramente visualizado en la superficie del cerebro (A) y en el procedimiento de parénquima siguiente aclaración (B).
Figura 2. Microscopio de campo claro imágenes aclaró cerebro vascular fundido. El cerebro se pueden obtener imágenes en diferentes planos y en diferentes niveles de ampliación. Barra de escala 200μm (A) y 50 micras (B).
Figura 3. Disección de imagen microscópica muestra a 1x ratón adulto cerebrovasculature todo el cerebro de una vista dorsal.
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Figura 4. Micro-TC imagen de la misma de todo el cerebro del ratón adulto se muestra en la Figura 3 a partir de una vista dorsal.
Figura 5. Aplicación del método de fundición vascular para detectar una malformación arteriovenosa cerebral. A) Micro-TAC de cerebro vascular fundido muestra ampliada de la región, irregular AVM-como los vasos en el hemisferio derecho de una vista ventral. Imagen ampliada de la región (caja blanca) se muestra a la derecha. B) Lo mismo que los vasos irregulares visualizaron bajo microscopio de campo claro con un aumento de 50x. Barra de escala 50 micras.
Discussion
Presentamos aquí un método para la fundición de cerebrovasculature ratón adulto que puede ser fotografiada con diversas modalidades. La aplicación de este método a la BAVM modelo de la enfermedad permite el análisis en 3D de los vasos irregulares. Potencial de los futuros estudios incluyen la cuantificación de micro-CT imágenes, el análisis histológico de los tejidos, y el diagnóstico de la progresión de la enfermedad vascular.
Problemas comunes y Sugerencias
Perfusión completa de la vasculatura del cerebro no siempre se logra. Tener la presión suficiente para llegar a los vasos sanguíneos distal sin romper la aurícula izquierda o en la aorta es un reto. Para superar esto, aplique una presión constante de aproximadamente 100 mmHg. Además, ajuste de posición de aguja para asegurar flujo adecuado de fundición de agente en la aorta. Es importante que las arterias carótidas no se limitan por lo que el agente de casting puede llegar a los vasos cerebrales. Los procedimientos fundamentales que se relacionan con la mejora pequeña embarcación porde fusión son: (1) limpieza adecuada de la sangre de los vasos, (2) la filtración de la agente de casting, y (3) colocación de la aguja durante la inyección de agente de casting. Se debe tener cuidado para evitar la inyección de agente de fundición en la aurícula izquierda y el pulmón. Otros investigadores han logrado perfundidos ratón de 3 y 4 cerebrovasculature rata sin utilizar procedimientos adicionales. Análisis manual de los vasos perfundidos Microfil contrastados con hematoxilina mostró 93% del lumen de perfusión vaso 5. Siempre deseche o completamente limpia cualquier herramienta que se pone en contacto con el agente de casting, ya que se polimeriza rápidamente, y las herramientas no se puede utilizar para varios temas. Aclaración del tejido del cerebro del ratón rodea puede ser un reto. Después de la inmersión en salicilato de metilo, el tejido puede aparecer opaco, lo que hace difícil imágenes embarcación. Garantizar la correcta deshidratación y aclaración debe resolver este problema. La colocación de tejido cerebral en una mecedora en alcohol metílico y el salicylate tratamiento puede mejorar la clarificación de tejidos.
Inconvenientes de la técnica
Las limitaciones de esta técnica son: (1) es necesario para inyectar la solución de agente de casting inmediatamente después de mezclarlo, ya que se espesa rápidamente después de que el catalizador se agrega, (2) el agente de casting llena de grandes vasos de conductancia con facilidad, pero no fiable llenar recipientes más pequeños, tales como las arteriolas (vasos de resistencia) y capilares (vasos nutritivos), y (3) no es el mejor contraste radio-opaco para las micro-TC, aunque algunos grupos prefieren Microfil de micro-TC 1,6. Sin embargo, a raíz de las sugerencias propuestas por encima, incluso colocación de la aguja, la posición del buque y la presión de perfusión, la fundición completa de los buques más pequeños se puede lograr. La adaptabilidad a las diferentes herramientas de análisis que hace este agente en una herramienta valiosa para el análisis de la estructura cerebral, incluyendo la circulación arterial y venosa, con variosperspectivas.
Aplicaciones de la técnica
La ventaja de este método es su potencial de aplicación general. El reparto se llena todos los buques, incluyendo las arterias, venas y capilares de todos los tejidos dentro del cuerpo, por lo que las estructuras vasculares en múltiples órganos de diferentes especies pueden ser analizados. Anteriormente, otros grupos han usado esta perfusión de grandes 7 y pequeños 8 buques en humanos, el mono 9, 10 ovejas, ratas 4,11,12, y el ratón 3,13. Vamos a demostrar la evidencia de la utilización de esta técnica en el análisis de la estructura de la microvasculatura del cerebro del ratón, en los estados sanos y enfermos 2. Además, hay soluciones Microfil con viscosidades disponibles para perfundir los vasos de diferentes tamaños y diferentes colores para mejorar la visualización de los vasos en varios órganos. Por ejemplo, el rojo puede verse fácilmente en el parénquima cerebral pálido y amarillo contrasta conde color rojo oscuro miocardio. Por otra parte, ya que el material es radiopaco, vasos se pueden crear imágenes con micro-tomografía computarizada para obtener una imagen en 3D rotativo. El tejido también se puede utilizar para cortes de parafina y el análisis histológico después de ser fotografiado.
Conclusión
Estamos aquí demostrar un protocolo para hacer un reparto vascular de los vasos sanguíneos del cerebro del ratón adulto, que puede ser adaptado con una variedad de técnicas de análisis para estudiar la estructura morfológica de la cerebrovasculature. También hemos proporcionado evidencia de la aplicación de este método a un modelo de estado de la enfermedad BAVM, representado por los buques ampliada, de forma irregular que la derivación de sangre arterial a la circulación venosa. Hay una variedad de métodos de fundición disponibles vascular. El protocolo simple que ofrecemos aquí un elenco vascular puede ser utilizado como una herramienta para examinar el sistema vascular del cerebro del ratón adulto utiliza diversas modalidades de imagen.
Disclosures
Los procedimientos experimentales para el uso de animales de laboratorio fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de California, San Francisco (UCSF).
Acknowledgments
Los autores agradecen a Voltaire Gungab de asistencia con la preparación del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de: los Institutos Nacionales de Salud (T32 GM008440 a EJ Walker, R01 NS27713 a WL Young, P01 NS44155 a WL jóvenes y Su H.), y el R21 NS070153 de H. Su, y el americano Heart Association (AHA 10GRNT3130004 de H. Su).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
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