Cerebrovaskulær Støping av Adult Mouse for 3D Imaging og morfologisk analyse

Summary

I denne artikkelen presenterer vi en enkel, praktisk teknikk for cerebrovaskulære casting som er enkel å utføre og kan utnyttes til bildet den vaskulære tre av den voksne musen hjernen.

Abstract

Vaskulær bildebehandling er viktig i klinisk diagnostikk og behandling av cerebrovaskulære sykdommer, for eksempel hjerne arteriovenøse misdannelser (BAVMs). Dyremodeller er nødvendig for å studere etiopathology og potensielle terapier for cerebrovaskulære sykdommer. Imaging blodkar i store dyr er relativt enkelt. Imidlertid utvikler fartøy avbildning metoder for murine hjernesykdom modeller ønskelig på grunn av kostnader og tilgjengelighet av genmodifiserte mus linjer. Imaging den murine cerebral vaskulær treet er en utfordring. Hos mennesker og større dyr, gullstandarden for å vurdere angioarchitecture på makrovaskulære (konduktans) nivået er x-ray kateter contrast-baserte angiografi, en metode ikke er egnet for små gnagere.

I denne artikkelen presenterer vi en metode for cerebrovaskulær casting som gir en holdbar skjelett av hele vaskulære sengen, inkludert arterier, vener og kapillærer som kan analyseres ved hjelp av mange different modaliteter. Komplett støping av microvessels av musen cerebrovasculature kan være vanskelig, men er disse utfordringene adressert i denne steg-for-steg protokollen. Gjennom intracardial perfusjon av vaskulære casting materiale, er alle fartøyer av kroppen avgitt. Hjernen kan da tas ut og avklares med organiske løsemidler metyl salicylate. Tredimensjonal avbildning av hjernen blodkar kan visualiseres enkelt og rimelig med enhver konvensjonell lysfelt mikroskop eller dissekere mikroskop. Den støpt cerebrovasculature kan også avbildes og kvantifiseres ved hjelp av mikro-computertomografi (micro-CT) ^1. I tillegg, etter å ha blitt fotografert, kan støpt hjernen være innebygd i parafin for histologisk analyse.

Fordelen med denne vaskulær casting metoden i forhold til andre teknikker er dens brede tilpasning til ulike analyseverktøy, herunder lysfelt mikroskopisk analyse, CT-skanning på grunn av røntgentett karakterteristic av materialet, samt histologiske og immunhistokjemiske analyser. Denne effektiv bruk av vev kan spare dyr bruk og redusere kostnadene. Vi har nylig demonstrert anvendelsen av denne metoden for å visualisere uregelmessig blodkar i en mus modell av voksen BAVM på et mikroskopisk nivå ^2, og gi ytterligere bilder av misdannede fartøy fotografert av mikro-CT scan. Selv om denne metoden har ulemper og kan ikke være ideelt for alle typer analyser, er det en enkel, praktisk teknikk som lett kan læres og er mye brukt til vaskulær støping av blodårer i hele kroppen.

Protocol

1. Clearing Blood fra vasculature

1. Anesthetize musen ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg ketamin med 10 mg / kg xylazin fortynnet i 0.25 ml saltvann.
2. Når bedøvelsen har blitt bekreftet av ingen svar på en pote klype, bruke saks for å lage et snitt tvers over brystet med saks like nedenfor xyphoid prosessen, skjære gjennom mellomgulvet, og kuttet opp mellom dorsal og ventral segment av brystkasse å avsløre brysthula. Expose hjertet ved folding opp brystbenet og tilstøtende brystveggen og sikker med hemostat. Åpne perikard sac med pinsett for å avsløre hjertet.
3. Slå på perfusjon pumpe (100mmHg trykk) koblet til varme PBS pluss heparin (5 enhet / ml) oppløsning i varmt vannbad ved 37 ° C og rør med en stump 22 gauge nål på utstrømningen.
4. Sett nålen inn i venstre hjertekammer, nær toppen av hjertet. Umiddelbart kutte åpne høyre atrium slik at systemisk blod strøm og fortsett skyllingen til blod ier fjernet fra sirkulasjon.

2. Perfusjon av Casting Agent i det vaskulære systemet

1. Forbered Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) støping løsning per produsentens protokoll: Mix 5 ml av MV fortynningsmiddel med 4 ml filtrert MV sammensatte. Legg 450μl (5%) av katalysator (MV herder). Løsning arbeidstid er 20 minutter, men mix umiddelbart før bruk for å sikre riktig viskositet.
2. Trekk casting agenten løsning i en 10ml sprøyte, feste en stump 20 gauge kanyle til sprøyten og fyll nål med løsningen.
3. Sett nål inn i venstre ventrikkel gjennom samme hullet som brukes til å spyle blodet. Sikker nål på plass med hemostat klemme på hjertet.
4. Injiser casting agenten løsning sakte inn i venstre hjertekammer på ca 3 ml / min. Overtrykk kan føre til uriktig flyt av casting agent eller potensielle fartøy ruptur.
5. Se etter tegn på vellykket perfusjon, inkludert: visualisering av støpting agent i tarm og lever blodkar, distal lem misfarging, og nese og tunge misfarging. Juster nål om nødvendig for å oppnå riktig perfusjon.

3. Innsamling og behandling av Tissue

1. Ta hjerne og plasser i 4% Paraformaldehyde over natten ved 4 ° C.
2. Dehydrere hjernen ved å plassere fra Paraformaldehyde direkte inn stadig mer konsentrert EtOH ved romtemperatur: 25% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 2 dager, og 100% EtOH, 2 dager .
3. Avklare hjernevev rundt blodårer ved å dyppe den perfused hjernen i metyl salicylate i 2 dager ved romtemperatur.
4. Vasculature av hele innlagt avklart hjernen kan avbildes med hjernen nedsenket i metyl salicylate under et dissekere mikroskop (Fig. 1) (Leica MZFL III mikroskop, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) eller lysfelt mikroskop (Fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
5. Reclarificationkan gjøres hvis vevet ikke er helt fjernet. Fra metyl salicylate, transfer hjernen til 95% EtOH for 2 dager, 100% EtOH for 2 dager, og metyl salicylate for 2 dager.

Fire. Micro-CT Imaging eller Histologiske Application-Tissue Forberedelse

1. Hjernen kan avbildes ved hjelp av micro-CT direkte etter avklaring eller etter re-hydrering (fig 4).
2. For å forberede hjernevev for histologiske analyse, rehydrere hjernen gjennom seriell fortynnet EtOH: 100% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 2 dager, 25% EtOH, 2 dager , og lagrer i PBS. Hjernen kan da bygges inn i parafin ved hjelp av en standard prosedyre.

5. Representant Resultater

Etter vaskulær støping, kan cerebrovasculature sees makro på hjernen overflate (Fig.1A). Den vaskulære tree inne i parenchyma kan visualiseres følgende avklaring (Fig. 1B). Den detaljerte vaskulær strukturkan avbildes og analyseres under et lysfelt mikroskop (Fig. 2), dissekere omfang (Fig. 3), og med mikro-CT-skanning (fig 4). Ved hjelp av lysfelt mikroskopi, kan blodkar ses på ulike fokus fly uten seksjonering hjernen (Fig. 2A) samt individuelle microvessels ved høyere forstørrelse (Fig. 2B). Under en dissecting omfang, kan man se hele vaskulære strukturen i ett fokusplan, noe som gir bedre visualisering av den tredimensjonale strukturen i cerebrovasculature (Fig. 3). Bilder tatt under et dissekere mikroskop kan vise stort fartøy morfologi og hele hjernen blodkar, men mangler detaljer vist på bilder tatt med lysfelt mikroskopi (Fig. 2B). Denne teknikken har tillatt oss å avdekke uregelmessig fartøy i våre eksperimentelle BAVM voksen mus modell ^2. Figur 5 viser et eksempel på det samme uregelmessige skipene oppdaget av mikro-CT-skanning (Fig. 5A) og lysfelt mikroskop (Fig. 5B). Sammen viser disse dataene at vi kan analysere than samme prøve med flere tenkelig verktøy etter vaskulær støping.

Figur 1. Whole mus hjernen følgende vaskulær casting. Før (A) og etter (B) avklaring av metyl salicylate løsemiddel. Fartøy kan være tydelig visualisert på hjernen overflaten (A) og i parenchyma følgende avklaring prosedyre (B).

Figur 2. Lysfelt mikroskop bilder av avklart vaskulær støpte hjernen. Brain kan avbildes på forskjellige fly og på ulike forstørrelse nivåer. Scale Bar 200μm (A) og 50μm (B).

Figur 3. Dissekere mikroskop image på 1x som viser hele den voksne mus hjernen cerebrovasculature fra en dorsal visning.

<img alt = "Figur 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" />
Figur 4. Micro-CT scanning bilde av den samme hele den voksne mus hjernen vist i figur 3 fra en dorsal visning.

Figur 5. Påføring av vaskulær casting metode for å oppdage en hjerne arteriovenøs malformasjon. A) Micro-CT scan av vaskulær støpte hjernen viser regionen forstørret, uregelmessig AVM-lignende fartøy i høyre hjernehalvdelen fra en ventral visning. Forstørret bilde av regionen (hvit boks) er vist til høyre. B) Samme uregelmessig fartøy visualisert i henhold lysfelt mikroskop ved 50x forstørrelse. Scale bar 50 mikrometer.

Discussion

Vi rapporterer her en metode for støping av voksen mus cerebrovasculature som kan avbildes med ulike modaliteter. Anvendelse av denne metoden for sykdommen modell BAVM muliggjør 3D-analyse av uregelmessig fartøy. Potensielle fremtidige studier inkludere kvantifisering av mikro-CT-bilder, histologiske analyser av vev, og diagnostisering av vaskulær sykdom progresjon.

Vanlige problemene og forslag

Komplett perfusjon av hjernen blodkar er ikke alltid oppnås. Å ha nok trykk til å nå distale blodkar uten rupturing venstre atrium eller aorta er en utfordring. For å overvinne dette, gjelder konsekvent trykket på ca 100mmHg. Også justere nålposisjon å sikre hensiktsmessig strøm av casting agenten inn i aorta. Det er viktig at carotis ikke er begrenset slik at casting agent kan nå hjernen fartøy. Kritiske prosedyrer som korrelerer med forbedret små fartøy perfusjon er: (1) skikkelig clearing av blodet fra blodkar, (2) filtrering av casting agent; og (3) nål plassering under støping agenten injeksjon. Forsiktighet bør utvises for å unngå injeksjon av casting agenten inn i venstre atrium og lunge. Andre forskere har lykkes perfused mus ³ og rotte ⁴ cerebrovasculature uten å bruke ekstra prosedyrer. Manuell analyse av Microfil perfused fartøy kontrafarget med hemotoxylin viste 93% fartøy lumen perfusjon ^5. Alltid forkaste eller helt ren noen verktøy som kommer i kontakt med casting agenten som det vil polymerisere raskt, og verktøyene kan ikke brukes for flere fag. Avklaring av de omkringliggende musen hjernevevet kan være utfordrende. Etter nedsenking i metyl salicylate, kan vevet fortsatt vises ugjennomsiktig, noe som gjør skipet bildebehandling vanskelig. Sikre riktig dehydrering og avklaring bør løse dette problemet. Plassering av hjernevev på en rocker i alkohol og metyl eralicylate behandling kan bedre vev avklaring.

Ulemper av teknikken

Begrensningene med denne teknikken er: (1) det er nødvendig å injisere casting agenten løsningen umiddelbart etter blande det som det blir tykkere raskt etter katalysatoren er lagt, (2) støping agenten fyller store konduktans fartøyer lett, men det gjør ikke pålitelig fylle mindre skip, som for eksempel arterioler (motstand fartøy) og kapillærer (næringsrik fartøy) og (3) det er ikke den beste røntgentett kontrasten for mikro-CT bildebehandling, selv om noen grupper foretrekker Microfil for mikro-CT bildebehandling ^1,6. Men etter forslagene foreslått ovenfor, inkludert riktig nål plassering, fartøyets posisjon og perfusjon press, kan fullføre støping av mindre fartøy oppnås. Tilpasningsevne til ulike analyseverktøy som gjør denne agenten et verdifullt verktøy for å analysere cerebrovaskulære struktur, inkludert arterielle og venøse sirkulasjon, med ulikeperspektiver.

Anvendelser av teknikken

Fordelen med denne metoden er dens bred anvendelse potensial. Kastet fyller alle fartøyer, herunder arterier, vener og kapillærer i alle vev i kroppen, så vaskulære strukturer i flere organer av ulike arter kan analyseres. Tidligere har andre grupper benyttet denne perfusjon for stor ⁷ og små ^åtte fartøy i human, monkey ^9, sauer ^10, rotte ^4,11,12 og mus ^3,13. Vi viser nå tegn til å bruke denne teknikken i å analysere strukturen av microvessels i musen hjernen, både friske og syke tilstander ^2. I tillegg er det Microfil løsninger med ulike viskositeter tilgjengelig for perfuse skip av forskjellige størrelser og forskjellige farger for å forbedre visualiseringen av fartøyene i ulike organer. For eksempel kan rødt være lett visualiseres i den bleke hjernen parenchyma, og gule kontraster godt medmørk rød myokard. Videre, ettersom materialet er røntgentett, kan vasculature bli fotografert med micro-CT-skanning for å oppnå en 3D roterbart bilde. Vevet kan også brukes for parafin seksjoner og histologiske analyser etter å ha blitt avbildet.

Konklusjon

Vi viser her en protokoll for å gjøre en vaskulær kastet av blodårene i den voksne musen hjernen, som kan tilpasses ved hjelp av en rekke analyse teknikker for å studere den morfologiske strukturen i cerebrovasculature. Vi har også gitt bevis for anvendelsen av denne metoden til en modell av BAVM sykdommen staten, representert ved forstørret, uregelmessig formet fartøy som shunt blod fra arteriell til venøse opplag. Det er en rekke av vaskulær støpemetoder tilgjengelig. Den enkel protokoll vi leverer her for en vaskulær kastet kan brukes som et verktøy for å undersøke blodkar av den voksne mus hjernen ved hjelp av ulike bildediagnostikk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microfil	FlowTech	MV130	4 month shelf life
Methyl Salicylate	Fisher Scientific	O3695-500	to clarify tissue