Summary
In dit artikel presenteren we een eenvoudige, praktische techniek voor cerebrovasculaire gieten, dat is eenvoudig uit te voeren en kan worden gebruikt om het imago van de vasculaire boom van de volwassen hersenen van muizen.
Abstract
Vasculaire beeldvorming is cruciaal in de klinische diagnostiek en behandeling van cerebrovasculaire ziekten, zoals de hersenen arterioveneuze malformaties (BAVMs). Diermodellen zijn nodig voor het bestuderen van de etiopathology en mogelijke therapieën van cerebrovasculaire ziekten. Beeldvorming van het vaatstelsel in de grote dieren is relatief eenvoudig. Echter, het ontwikkelen van schip imaging methoden van murine hersenziekte modellen wenselijk is te wijten aan de kosten en beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muis lijnen. Beeldvorming van de muizen cerebrale vasculaire boom is een uitdaging. Bij de mens en grotere dieren, de gouden standaard voor de beoordeling van de angioarchitecture op de macrovasculaire (geleiding) niveau is x-ray katheter contrast op basis van angiografie, een methode niet geschikt is voor kleine knaagdieren.
In dit artikel presenteren we een methode van cerebrovasculaire gieten die een duurzaam skelet van de gehele vaatbed produceert, waaronder slagaders, aders, en haarvaten die kunnen worden geanalyseerd met behulp van een groot aantal dAllerlei mensen modaliteiten. Volledige casting van de microvaten van de muis cerebrovasculature kan moeilijk zijn, maar deze uitdagingen komen aan bod in deze stap-voor-stap protocol. Door intracardiale perfusie van de vasculaire casting materiaal, zijn alle schepen van het lichaam gegoten. De hersenen kunnen dan worden verwijderd en verduidelijkt met behulp van het organische oplosmiddel methyl salicylaat. Driedimensionale beeldvorming van de hersenen de bloedvaten kan eenvoudig en goedkoop worden gevisualiseerd met een conventionele helderveld microscoop of ontleden microscoop. De gegoten cerebrovasculature kan ook worden afgebeeld en gekwantificeerd met behulp van micro-computertomografie (micro-CT) 1. Daarnaast, na in beeld wordt gebracht, kunnen de hersenen gegoten worden ingebed in paraffine voor histologische analyse.
Het voordeel van deze vasculaire casting methode in vergelijking met andere technieken is haar brede aanpassing aan de verschillende analytische instrumenten, waaronder helderveld microscopische analyse, CT-scan te wijten aan de radiopake kenmerkenKenmerkend voor het materiaal, maar ook histologische en immunohistochemische analyse. Deze efficiënte gebruik van weefsel kan redden van dieren het gebruik en de kosten te verlagen. We hebben onlangs aangetoond toepassing van deze methode om de onregelmatige bloedvaten in een muis model van de volwassen BAVM te visualiseren op een microscopisch niveau 2, en bieden extra beelden van de misvormde schepen afgebeeld door micro-CT scan. Hoewel deze methode heeft nadelen en is wellicht niet ideaal voor alle soorten van analyses, het is een eenvoudige, praktische techniek die gemakkelijk geleerd kan worden en op grote schaal toegepast op vasculaire gieten van de bloedvaten door het hele lichaam.
Protocol
1. Clearing Bloed van vasculatuur
- Verdoven muis door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine met 10 mg / kg xylazine verdund in 0,25 ml zoutoplossing.
- Als de verdoving eenmaal is bevestigd door geen reactie op een poot snuifje, gebruik schaar om een incisie te maken over de borst met een schaar net onder de xyphoid proces, snijd diafragma, en de in stukken gesneden tussen de dorsale en ventrale segment van de ribbenkast naar borstholte bloot te leggen. Expose hart door het vouwen van het borstbeen en aangrenzende borstwand en veilig met hemostat. Open de pericardiale zak met een pincet om het hart bloot te leggen.
- Zet perfusie pomp (100 mm Hg druk) is aangesloten op PBS plus heparine (5 eenheden / ml) oplossing in warm waterbad bij 37 ° C en buis met een stompe 22 gauge naald op de uitstroom. Warme
- Steek de naald in de linker ventrikel, de buurt van de top van het hart. Onmiddellijk opengesneden het recht atrium tot systemische bloed uitstroom mogelijk te maken en blijven spoelen totdat de bloeddruk is uit de circulatie.
2. Perfusie van Casting Agent in het vasculaire systeem
- Bereid Microfil (Flow Tech, Inc Carver, MA) gietoplossing per protocol van de fabrikant: Mix 5 ml van de MV oplosmiddel met 4 ml gefilterd MV verbinding. Voeg 450μl (5%) van de katalysator (MV verharder). Oplossing werktijd is 20 minuten, maar mengen onmiddellijk voor gebruik om de juiste viscositeit te garanderen.
- Terug te trekken casting agent oplossing in een 10 ml spuit, voeg een stompe 20 gauge naald op de spuit en vul de naald met de oplossing.
- Steek de naald in de linker ventrikel door dezelfde opening gebruikt voor het spoelen van het bloed. Veilige naald op zijn plaats met hemostaat klem op het hart.
- Injecteer casting agent oplossing langzaam in de linker ventrikel op ongeveer 3 ml / min. Overdruk kan leiden tot onjuiste stroom van casting agent of potentiële schip breuk.
- Kijk naar tekenen van een succesvolle perfusie, zoals: visualisatie van castING agent in darm en lever vaatstelsel, distale ledematen verkleuring, en neus en tong verkleuring. Stel de naald indien nodig voor een goede doorbloeding te bereiken.
3. Verzamelen en verwerken van Tissue
- 'S nachts te verwijderen hersenen en in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C.
- Uitdrogen hersenen door het plaatsen van paraformaldehyde direct in toenemende mate geconcentreerd EtOH bij kamertemperatuur: 25% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 2 dagen en 100% EtOH, 2 dagen .
- Verduidelijken hersenweefsel rondom de bloedvaten door onderdompeling van de perfusie hersenen in methylsalicylaat gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur.
- Vaatstelsel van de hele unsectioned verduidelijkt hersenen kunnen worden afgebeeld met de hersenen ondergedompeld in methylsalicylaat onder een dissectie microscoop (afb. 1) (Leica MZFL III microscoop, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) of helderveld microscoop (afb. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
- Reclarificationkan worden gedaan als weefsel is niet volledig gewist. Vanaf methylsalicylaat, transfer hersenen tot 95% EtOH voor 2 dagen, 100% EtOH voor 2 dagen, en methylsalicylaat voor 2 dagen.
4. Micro-CT Imaging of histologische Applicatie-Tissue Voorbereiding
- De hersenen kunnen worden afgebeeld met behulp van micro-CT direct na verduidelijking of na de re-hydratatie (afb. 4).
- Ter voorbereiding hersenweefsel voor histologische analyse, hydrateren de hersenen via seriële verdund EtOH: 100% EtOH, 1 dag, 95% EtOH, 1 dag, 75% EtOH, 1 dag, 50% EtOH, 2 dagen, 25% EtOH, 2 dagen , en op te slaan in PBS. De hersenen kunnen dan worden ingebed in paraffine behulp van een standaard procedure.
5. Representatieve resultaten
Naar aanleiding van vasculaire gieten, kan de cerebrovasculature macroscopisch te zien is op de hersenen oppervlak (Fig.1A). De vasculaire boom in het parenchym kan gevisualiseerd volgende verduidelijking te worden (Fig. 1B). De gedetailleerde vasculaire structuurkunnen worden afgebeeld en geanalyseerd onder een helderveld microscoop (afb. 2), ontleden scope (afb. 3), en met micro-CT-scan (afb. 4). Met behulp van helderveld microscopie, kan het vaatstelsel worden bekeken op verschillende brandpunten vliegtuigen zonder snijden in de hersenen (Fig. 2A), alsmede individuele microvaten bij hogere vergroting (Fig. 2B). Onder een ontleding scope, kan men de gehele vasculaire structuur te zien in een focal plane, waardoor een betere visualisatie van de driedimensionale structuur van de cerebrovasculature (afb. 3). Foto's genomen in het kader een dissectie microscoop kan laten zien grote schip de morfologie en de hele hersenen vaatstelsel, maar missen de details getoond in foto's die met helderveld microscopie (Fig. 2B). Deze techniek heeft ons in staat om onregelmatige schepen op te sporen in onze experimentele BAVM volwassen muis model 2. Figuur 5 toont een voorbeeld van dezelfde onregelmatige schepen gedetecteerd door micro-CT scan (Fig. 5A) en helderveld microscoop (Fig. 5B). Samen vormen deze gegevens blijkt dat we kunnen analyseren thij hetzelfde monster met meerdere imaging-gereedschap na vasculaire gieten.
Figuur 1. Whole hersenen van muizen na vasculaire gieten. Voor (A) en na (B) klaring door methylsalicylaat oplosmiddel. Schepen kunnen duidelijk gevisualiseerd worden op de hersenen oppervlak (A) en in parenchym volgende toelichting procedure (B).
Figuur 2. Helderveld microscoop beelden van verduidelijkt vasculaire gegoten hersenen. Hersenen kunnen worden afgebeeld op verschillende vlakken en op verschillende niveaus vergroting. Schaal Bar 200μm (A) en 50μm (B).
Figuur 3. Dissectiemicroscoop beeld in 1x met hele volwassen hersenen van muizen cerebrovasculature uit een dorsaal aanzicht.
<img alt = "Figuur 4" src = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" />
Figuur 4. Micro-CT-scan beeld van hetzelfde geheel volwassen hersenen van muizen getoond in figuur 3 uit een dorsaal aanzicht.
Figuur 5. Toepassing van vasculaire casting methode om de hersenen een arterioveneuze misvorming op te sporen. A) Micro-CT scan van de hersenen toont vasculaire gegoten regio vergroot, onregelmatig AVM-achtige schepen in rechterhersenhelft van een ventrale te bekijken. Vergroot de afbeelding van de regio (witte doos) wordt weergegeven aan de rechterkant. B) Zelfde onregelmatige schepen zichtbaar onder helderveld microscoop met 50x vergroting. Schaalbalk 50 um.
Discussion
Wij rapporteren hier een methode voor het gieten van de volwassen muis cerebrovasculature die kunnen worden afgebeeld met verschillende modaliteiten. De toepassing van deze methode om de ziekte model BAVM maakt 3D-analyse van onregelmatige schepen. Potentiële toekomstige studies omvatten kwantificering van micro-CT beelden, histologische analyse van weefsel, en de diagnose van vasculaire progressie van de ziekte.
Problemen die zich en suggesties
Volledige doorbloeding van de hersenen vasculatuur is niet altijd bereikt. Genoeg druk om de distale bloedvaten te bereiken zonder open te barsten de linker-atrium of aorta is een uitdaging. Om dit van toepassing consistente druk van ongeveer 100 mmHg. Ook passen de naald positie passende uitstroom van casting agent in de aorta te verzekeren. Het is belangrijk dat de halsslagaders niet worden beperkt, zodat de casting agent kan de hersenen bereiken schepen. Kritische procedures die samenhangen met een verbeterde klein schip perfusie zijn: (1) de goede afwikkeling van het bloed van het vaatstelsel, (2) filtratie van de casting agent, en (3) naald plaatsing tijdens de casting agent injectie. Zorg moet worden genomen om de injectie van casting agent in de linkerboezem en de longen te voorkomen. Andere onderzoekers hebben met succes doorbloed muis en rat 3 4 cerebrovasculature zonder extra procedures. Handmatige analyse van Microfil geperfuseerd schepen tegengekleurd met hemotoxylin toonde 93% schip lumen perfusie 5. Altijd ontdoen of zich helemaal schoon is een tool die in contact komt met de casting agent omdat het snel polymeriseren, en gereedschappen kunnen niet worden gebruikt voor meerdere onderwerpen. Verduidelijking van het omliggende hersenweefsel muis kan een uitdaging zijn. Na de onderdompeling in methylsalicylaat, kan het weefsel nog steeds weergegeven ondoorzichtig, waardoor schip beeldvorming moeilijk. Zorgen voor een goede uitdroging en verduidelijking moet dit probleem oplossen. Het plaatsen van hersenweefsel op een rocker in alcohol en methyl-salicylate behandeling kan verbeteren weefsel verduidelijking.
Nadelen van de techniek
De beperkingen van deze techniek zijn onder andere: (1) is het noodzakelijk om de casting agent oplossing te injecteren onmiddellijk na het mengen het zoals het snel dikker na de katalysator wordt toegevoegd; (2) de casting agent vult grote geleiding schepen gemakkelijk, maar niet betrouwbaar te vullen kleinere schepen, zoals de arteriolen (weerstand schepen) en haarvaten (voedingswaarde schepen), en (3) het is niet de beste radiopake contrast voor micro-CT beeldvorming, hoewel sommige groepen liever Microfil voor micro-CT beeldvorming 1,6. Echter, naar aanleiding van de bovenstaande suggesties voorgesteld, waaronder de juiste naald plaatsing, positie van het schip en perfusie druk, kan volledige gieten van kleinere schepen worden bereikt. Het aanpassingsvermogen aan verschillende analyse-instrumenten maakt dit middel een waardevol instrument voor het analyseren van cerebrovasculaire structuur, met inbegrip arteriële en veneuze circulatie, met verschillendeperspectieven.
Toepassingen van de Techniek
Het voordeel van deze methode is de brede toepassing potentieel. De cast vult alle schepen, met inbegrip slagaders, aders en de haarvaten van alle weefsels in het lichaam, zodat vasculaire structuren in meerdere organen van de verschillende soorten kunnen worden geanalyseerd. Eerder hebben andere groepen gebruik gemaakt van deze perfusie voor grote 7 en 8 kleine schepen in de mens, aap 9, 10 schapen, rat 4,11,12 en muis 3,13. We tonen nu het bewijs van het gebruik van deze techniek in het analyseren van de structuur van de bloedvaten in de hersenen van muizen, zowel in gezonde en zieke Staten 2. Daarnaast zijn er Microfil oplossingen met verschillende viscositeiten voor vaartuigen van verschillende grootte en verschillende kleuren perfuseren aan de visualisatie van de vaartuigen in verschillende organen te verbeteren. Kunnen bijvoorbeeld rode gemakkelijk gevisualiseerd in de bleke hersenen parenchym, en geel contrasteert goed metdonkerrood myocard. Bovendien, als het materiaal is radiopaak, kunnen bloedvaten worden afgebeeld met micro-CT scan om een 3D-draaibare beeld te krijgen. Het weefsel kan ook gebruikt worden voor paraffine secties en histologische analyse na in beeld wordt gebracht.
Conclusie
We zien hier een protocol om een vasculaire cast van de bloedvaten van de volwassen hersenen van muizen, die kunnen worden aangepast met behulp van een verscheidenheid van analysetechnieken om de morfologische structuur van de cerebrovasculature studie te maken. Wij hebben ook bewijs geleverd voor de toepassing van deze methode om een model van de BAVM ziekte staat, vertegenwoordigd door vergroot, onregelmatig gevormde schepen die shunt arterieel bloed van de veneuze circulatie. Er zijn een verscheidenheid van vasculaire casting methoden beschikbaar. De eenvoudige protocol we hier zorgen voor een vasculaire gegoten kan worden gebruikt als een instrument om het vaatstelsel van de volwassen hersenen van muizen met behulp van verschillende beeldvormende technieken te onderzoeken.
Disclosures
Experimentele procedures voor het gebruik van proefdieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de University of California, San Francisco (UCSF).
Acknowledgments
De auteurs danken Voltaire Gungab voor hulp bij het manuscript voorbereiding. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van: de National Institutes of Health (T32 GM008440 naar EJ Walker, R01 NS27713 aan WL Young, P01 NS44155 aan WL Jong en H. Su) en R21 NS070153 naar H. Su, en de Amerikaanse Heart Association (AHA 10GRNT3130004 naar H. Su).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
References
- Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs. Bone. 43, 195-202 (2008).
- Walker, E. J. Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease. Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).
- Iqbal, U. Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).
- Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat. 145, 473-480 (2003).
- Chugh, B. P. Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography. Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. ainey, L, L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).
- Fossett, D. T., Caputy, A. J. Operative Neurosurgical Anatomy. , Thieme Medical Publishers. New York. (2002).
- Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta). Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).
- Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).
- Brady, J. M., Cutright, D. E. A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat. Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).
- Evan, A. P., Dail, W. G. Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney. Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
