Summary
Neste artigo, apresentamos uma técnica simples e prática para a fundição cerebrovascular que é fácil de executar e pode ser utilizado para a imagem da árvore vascular do cérebro do rato adulto.
Abstract
Vasculares imagem é crucial para o diagnóstico clínico e tratamento das doenças cerebrovasculares, como malformações arteriovenosas cerebrais (BAVMs). Modelos de animais são necessários para estudar as terapias etiopatogenia e potencial de doenças cerebrovasculares. Imagem da vasculatura em animais de grande porte é relativamente fácil. Entretanto, os métodos de imagem navio desenvolvimento de modelos murinos doença cérebro é desejável devido ao custo e disponibilidade de linhas geneticamente modificados mouse. Imagem da árvore vascular cerebral murina é um desafio. Em humanos e animais maiores, o padrão-ouro para avaliar a angioarquitetura no macrovascular (condutância) nível é x-ray cateter baseado em contraste angiografia, um método não é adequado para pequenos roedores.
Neste artigo, apresentamos um método de fundição cerebrovascular que produz um esqueleto duráveis de todo o leito vascular, incluindo artérias, veias e capilares que podem ser analisados usando d muitosmodalidades IFERENTES. Fundição completo dos microvasos da cerebrovasculature mouse pode ser difícil, no entanto, estes desafios são abordadas neste protocolo passo a passo. Por meio de perfusão intracardíaca do material de fundição vascular, todos os vasos do corpo são fundidos. O cérebro pode então ser removido e clarificado com o salicilato de metila solvente orgânico. Três dimensional imagem dos vasos sanguíneos do cérebro pode ser visualizado de forma simples e barata com qualquer microscópio de campo claro convencional ou microscópio de dissecação. O cerebrovasculature casted também pode ser trabalhada e quantificados utilizando micro-tomografia computadorizada (micro-CT) 1. Além disso, depois de ser fotografada, o cérebro fundido pode ser incluído em parafina para análise histológica.
O benefício deste método de fundição vascular, em comparação com outras técnicas é a sua ampla adaptação a diversas ferramentas analíticas, incluindo brightfield análise microscópica, tomografia computadorizada, devido à características radiopacoapanágio do material, bem como a análise histológica e imuno-histoquímico. Este uso eficiente de tecido pode salvar utilização de animais e reduzir os custos. Recentemente, demonstrou aplicação deste método para visualizar os vasos sanguíneos irregulares em um modelo do rato de BAVM adulto em um nível microscópico 2, e fornecer imagens adicionais dos vasos malformados fotografada por micro-tomografia computadorizada. Embora este método tem desvantagens e não pode ser ideal para todos os tipos de análises, é uma técnica simples e prática que pode ser facilmente aprendido e amplamente aplicado para fundição vascular dos vasos sanguíneos em todo o corpo.
Protocol
1. Limpeza de sangue de Vascularização
- Anestesiar rato por injeção intraperitoneal de ketamina 100 mg / kg de xilazina com 10 mg / kg diluído em solução salina 0,25 ml.
- Uma vez que a anestesia foi confirmada por nenhuma resposta a uma pitada de pata, use a tesoura para fazer uma incisão no peito com uma tesoura, logo abaixo do apêndice xifóide, corte através do diafragma, e retira-se entre o segmento dorsal e ventral das costelas para expor cavidade torácica. Expor o coração, dobrando-se esterno e parede torácica adjacente e seguro com pinça hemostática. Abra o saco pericárdico com pinças para expor o coração.
- Ligue bomba de perfusão (100mmHg de pressão) conectado a quente PBS acrescido de heparina (5 unidades / ml) solução em banho de água quente a 37 ° C e os tubos com uma agulha de calibre 22 sem corte na saída.
- Inserir a agulha para o ventrículo esquerdo, perto do ápice do coração. Imediatamente cortado do átrio direito para permitir saída arterial sistêmica e continue lavando até que o sangue is retirado de circulação.
2. Perfusão de agente de elenco no Sistema Vascular
- Prepare Microfil (Flow Tech, Inc. Carver, MA) Solução de fundição por protocolo do fabricante: Misturar 5 ml de diluente MV com 4 ml de composto MV filtrada. Adicionar 450μl (5%) de catalisador (MV agente de cura). Tempo de solução de trabalho é de 20 minutos, mas mistura imediatamente antes do uso para assegurar viscosidade adequada.
- Retirar fundição solução de agente para uma seringa de 10 ml, juntar uma agulha de calibre 20 e blunt a seringa e agulha preencher com a solução.
- Inserir a agulha para o ventrículo esquerdo através do mesmo buraco utilizado para a lavagem do sangue. Agulha segura no lugar com pinça hemostática no coração.
- Injectar a solução lentamente agente de elenco para o ventrículo esquerdo em cerca de 3 ml / min. Excesso de pressão pode levar ao incorreto de fluxo de agente de elenco ou ruptura navio potencial.
- Olhe para os sinais de perfusão de sucesso, incluindo: visualização do elencoing agente no intestino e fígado vasculatura, descoloração membro distal, e nariz e descoloração da língua. Reajuste agulha se necessário para alcançar a perfusão adequada.
3. Coleta e Processamento de Tecido
- Remover cérebro e colocar em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C.
- Desidratar cérebro, colocando de paraformaldeído diretamente em EtOH cada vez mais concentrados em temperatura ambiente: 25% EtOH, 1 dia, 50% EtOH, 1 dia, 75% EtOH, 1 dia, 95% EtOH, 2 dias, e 100% EtOH, 2 dias .
- Esclarecer o tecido cerebral ao redor dos vasos sanguíneos por imersão do cérebro perfundidos em salicilato de metila por 2 dias à temperatura ambiente.
- Vascularização do cérebro unsectioned todo esclarecidas podem ser visualizados com o cérebro imerso em salicilato de metila sob um microscópio de dissecação (Fig. 1) (Leica MZFL microscópio III, Leica Microsystems, Bannockburn, IL) ou microscópio de campo claro (Fig. 2) (Leica DM / LS, Leica Microsystems).
- Reclarificationpode ser feito se o tecido não está completamente esclarecido. De metil salicilato de transferência do cérebro, para EtOH 95% para 2 dias, 100% EtOH por 2 dias, e salicilato de metila por 2 dias.
4. Micro-CT imagem ou de Preparação de aplicação de tecidos-histológica
- O cérebro pode ser fotografada usando micro-CT logo após esclarecimento ou após a re-hidratação (Fig. 4).
- Para preparar o tecido cerebral para análise histológica, reidratar o cérebro através de EtOH diluída serial: 100% EtOH, 1 dia, 95% EtOH, 1 dia, 75% EtOH, 1 dia, 50% EtOH, 2 dias, 25% EtOH, 2 dias ; loja e na PBS. O cérebro pode então ser embebidos em parafina usando um procedimento padrão.
5. Resultados representante
Após vazamento vascular, o cerebrovasculature pode ser visto macroscopicamente na superfície do cérebro (Fig.1a). A árvore vascular no interior do parênquima podem ser visualizados seguinte esclarecimento (Figura 1B). A estrutura detalhada vascularpodem ser visualizados e analisados sob um microscópio de campo claro (Fig. 2), dissecando escopo (Fig. 3), e com micro-tomografia computadorizada (Fig. 4). Usando a microscopia de campo claro, a vasculatura podem ser vistos em diferentes planos focais, sem seccionamento do cérebro (Fig. 2A), bem como microvasos individuais em maior ampliação (Fig. 2B). De acordo com um escopo de dissecação, pode-se ver toda a estrutura vascular em um plano focal, permitindo melhor visualização da estrutura tridimensional do cerebrovasculature (Fig. 3). Imagens tiradas em um microscópio de dissecação pode mostrar a morfologia de grandes vasos e vascularização do cérebro inteiro, mas falta os detalhes mostrados em fotos tiradas com a microscopia de campo claro (Fig. 2B). Esta técnica permitiu-nos detectar embarcações irregulares no nosso modelo experimental do rato BAVM adulto 2. A Figura 5 mostra um exemplo de as mesmas embarcações irregulares detectadas pelo micro-tomografia computadorizada (Fig. 5A) e microscópio de campo claro (Fig. 5B). Juntos, esses dados mostram que podemos analisar tele mesma amostra com múltiplas ferramentas de imagem após a fundição vascular.
Figura 1. Cérebro de camundongo inteiro seguinte elenco vascular. Antes (A) e após (B) Clarificação por salicilato de metila solvente. Vasos podem ser claramente visualizados na superfície do cérebro (A) e no parênquima procedimento seguinte esclarecimento (B).
Figura 2. Brightfield imagens de microscópio do cérebro vascular casted esclareceu. Cérebro pode ser trabalhada em vários planos e níveis de ampliação diferentes. Escala Bar 200μm (A) e 50 ìm (B).
Figura 3. Dissecando imagem do microscópio em 1x mostrando todo adulto cerebrovasculature cérebro de camundongo a partir de uma visão dorsal.
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Figura 4. Micro-CT digitalização de imagens do cérebro do rato inteiro mesmo adulto mostrado na Figura 3 a partir de uma visão dorsal.
Figura 5. Aplicação do método de fundição vascular para detectar uma malformação arteriovenosa cerebral. A) Micro-CT scan do cérebro vascular casted mostra região de alargada, irregular AVM-como vasos no hemisfério direito do ponto de vista ventral. Imagem ampliada da região (caixa branca) é mostrado à direita. B) O mesmo embarcações irregulares visualizados sob microscópio de campo claro com ampliação de 50x. Barra de escala 50 mm.
Discussion
Nós relatamos aqui um método para fundição de cerebrovasculature rato adulto que pode ser trabalhada com diversas modalidades. Aplicação deste método para a BAVM modelo de doença permite a análise 3D dos vasos irregular. Potenciais futuros estudos incluem quantificação de micro-TC, a análise histológica do tecido, e diagnóstico de progressão da doença vascular.
Problemas comuns encontrados e Sugestões
Perfusão completa da vasculatura cerebral nem sempre é alcançado. Ter pressão suficiente para alcançar os vasos sanguíneos sem ruptura distal do átrio esquerdo ou aorta é um desafio. Para superar isso, aplicar uma pressão consistente de aproximadamente 100mmHg. Também, ajustar a posição da agulha para assegurar a vazão adequada de fundição agente para a aorta. É importante que as artérias carótidas não são restritas para que o agente de elenco pode atingir os vasos do cérebro. Procedimentos críticos que se correlacionam com pequenos vasos melhorou porfusão são: (1) remoção adequada do sangue dos vasos; (2) filtração do agente de elenco, e (3) a colocação da agulha durante a injeção do casting. Cuidados devem ser tomados para evitar a injecção de fundição agente para o átrio esquerdo eo pulmão. Outros investigadores com sucesso perfundidos mouse de 3 e 4 cerebrovasculature rato sem o uso de procedimentos adicionais. Análise manual dos vasos perfundidos Microfil contracorados com hemotoxylin mostrou 93% dos navios de perfusão lumen 5. Sempre descartar ou completamente limpa qualquer ferramenta que entra em contato com o agente de elenco como ele irá polimerizar rapidamente, e ferramentas não podem ser usados para diversos assuntos. Clarificação do tecido ao redor do mouse cérebro pode ser um desafio. Após imersão em salicilato de metila, o tecido ainda pode aparecer opaco, tornando difícil de imagem navio. Assegurar a desidratação adequada e esclarecimento deve resolver este problema. Colocação de tecido cerebral em um roqueiro durante álcool e metil salicylate tratamento pode melhorar a clarificação dos tecidos.
Desvantagens da técnica
As limitações dessa técnica incluem: (1) é necessário para injetar a solução de agente de elenco imediatamente após a mistura-lo como ele vai engrossar rapidamente após o catalisador é adicionado; (2) o agente de elenco enche vasos de condutância grande facilidade, mas não confiável encher vasos menores, tais como arteríolas (vasos de resistência) e capilares (vasos nutritivos) e (3) não é o melhor contraste radiopaco para micro-TC, embora alguns grupos preferem Microfil para micro-TC 1,6. No entanto, seguindo as sugestões propostas anteriormente, incluindo a colocação de agulha apropriada, a posição do navio e pressão de perfusão, casting completa de navios menores podem ser alcançados. A adaptabilidade a várias ferramentas de análise faz deste agente um valioso instrumento para analisar a estrutura cerebral, incluindo a circulação arterial e venosa, com váriasperspectivas.
Aplicações da Técnica
O benefício deste método é seu potencial de aplicação ampla. O elenco preenche todos os navios, incluindo artérias, veias, capilares e de todos os tecidos dentro do corpo, por isso as estruturas vasculares em vários órgãos de várias espécies podem ser analisados. Anteriormente, outros grupos têm utilizado este perfusão para grandes e pequenos 7 8 navios em humanos, macacos, 9 de ovelhas 10, ratos 4,11,12 e mouse 3,13. Vamos agora mostrar evidências do uso desta técnica na análise da estrutura de microvasos no cérebro do rato, em estados sãos e doentes 2. Além disso, existem soluções Microfil com viscosidades diferentes disponíveis para perfundir vasos de diferentes tamanhos e cores diferentes para melhorar a visualização dos vasos em vários órgãos. Por exemplo, o vermelho pode ser facilmente visualizado no parênquima cerebral pálido e amarelo contrasta bem com avermelho escuro miocárdio. Além disso, como o material é radiopaco, vasculatura podem ser visualizados com micro-tomografia computadorizada para obter uma imagem 3D giratório. O tecido também pode ser usado para cortes em parafina e análise histológica depois de ser fotografada.
Conclusão
Demonstramos aqui um protocolo para fazer um molde vascular dos vasos sanguíneos do cérebro do rato adulto, que podem ser adaptados usando uma variedade de técnicas de análise para estudar a estrutura morfológica do cerebrovasculature. Nós também fornecemos evidências para a aplicação deste método para um modelo do estado de doença BAVM, representado por alargada, as embarcações de forma irregular que o sangue de shunt arterial para as circulações venosa. Há uma variedade de métodos de fundição disponíveis vascular. O protocolo simples que oferecemos aqui para um elenco vascular pode ser usado como uma ferramenta para examinar a vascularização do cérebro do rato adulto usando diversas modalidades de imagem.
Disclosures
Procedimentos experimentais para a utilização de animais de laboratório foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Califórnia, San Francisco (UCSF).
Acknowledgments
Os autores agradecem Voltaire Gungab de assistência com a preparação do manuscrito. Este trabalho foi apoiado em parte por concessões: o National Institutes of Health (T32 GM008440 para EJ Walker, R01 NS27713 a WL Young, P01 NS44155 a WL Young e H. Su) e R21 NS070153 para H. Su, eo norte-americano Heart Association (AHA 10GRNT3130004 para H. Su).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
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