Summary
이 문서에서는, 우리는 수행하기 쉽고 이미지가 성인 마우스 뇌의 혈관 트리를 활용할 수 뇌혈관 캐스팅에 대한 간단한 실용적인 기술을 제시한다.
Abstract
혈관 영상은 두뇌 arteriovenous 기형 (BAVMs)와 같은 뇌혈관 질환의 임상 진단 및 관리에 중요합니다. 동물 모델은 뇌혈관 질환의 etiopathology 및 잠재적인 치료를 공부를 위해 필요합니다. 큰 동물 이미징 vasculature은 비교적 간단합니다. 그러나, murine 뇌 질환 모델 개발 선박 이미징 방법으로 인해 유전자 - 수정된 마우스 라인의 비용 및 가용성하는 것이 바람직하다. 이미징 murine 대뇌 혈관 나무는 도전입니다. 인간과 큰 동물 macrovascular에서 angioarchitecture을 평가하기위한 황금 표준 (전도성) 수준은 x - 선 카테터 대비 기반 혈관 조영술, 작은 설치류에 적합하지하는 방법입니다.
이 문서에서는, 우리는 많은 D를 사용하여 분석 수 있습니다 동맥, 정맥, 모세 혈관 및 포함 전체 혈관 침대의 내구성 뼈대를 생성 뇌혈관 주조하는 방법을 제시ifferent modalities. 마우스 cerebrovasculature의 microvessels의 완벽한 캐스팅이 어려울 수 있지만, 이러한 도전이 단계별로 프로토콜에서 해결됩니다. 혈관 주조 재료의 intracardial 재관류를 통해 신체의 모든 혈관이 casted 있습니다. 뇌는 그런 다음 제거하고 유기 용매 메틸 살리실산을 사용하여 명확히 수 있습니다. 뇌 혈관의 입체 영상은 어떤 종래의 brightfield 현미경 또는 해부 현미경으로 간단하고 저렴하게 시각하실 수 있습니다. casted cerebrovasculature도 몇 군데와 마이크로 계산된 tomography (마이크로 - CT) 1을 사용하여 계량하실 수 있습니다. 또한, 몇 군데 후에, casted 두뇌는 histological 분석을 위해 파라핀에 박혀 수 있습니다.
다른 기술에 비해이 혈관 주조 방법의 이점은 brightfield 현미경 분석을 포함하여, 다양한 분석 도구의 광범위한 적응이다, CT 인해 radiopaque의 charac로 검색자료뿐만 아니라 histological 및 immunohistochemical 분석 teristic. 조직이 효율적으로 사용 동물 사용을 저장하고 비용을 줄일 수 있습니다. 우리는 최근 미세한 수준 2 성인 BAVM의 마우스 모델에서 불규칙 혈관을 시각화하고, 마이크로 - CT 촬영에 의해 몇 군데 잘못된 혈관의 추가 이미지를 제공하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 증명하고있다. 이 방법은 단점을 가지고 있으며, 모든 종류의 분석에 적합하지 않을 수 있습니다지만, 쉽게 배운 널리 체내 혈관의 혈관 캐스팅에 적용할 수있는 간단하고 실용적인 기술입니다.
Protocol
1. Vasculature에서 혈액을 지우기
- 0.25 ML의 식염수에 희석 10 밀리그램 / kg xylazine 100 밀리그램 / kg 300ml의 intraperitoneal 주사하여 마우스를 마취.
- 마취가 발자국 꼬집어없이 반응에 의해 확인되면 다이어프램 쪽을 통과해서 바로 xyphoid 과정을 아래에 가위와 가슴팍 절개를 만들기 위해 가위를 사용하여 흉강을 폭로 ribcage의 지느러미와 복부 세그먼트 사이 했네요. 흉골과 인접 가슴 벽을 접는하고 hemostat과 보안에 의해 마음을 쉽게받을 수 있습니다. 마음을 노출 핀셋으로 pericardial SAC를 엽니다.
- PBS 플러스 헤파린 (5 단위 / ML) 37시 온수 욕조에서 솔루션 ° C 및 유출에 뭉툭한 22 게이지 바늘로 튜브.을 따뜻하게 연결 살수 펌프 (압력을 100mmHg)를 켜십시오
- 심장의 꼭대기 근처 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 즉시 전신 혈액 유출을 활성화 권리 아트리움을 열고 잘라 피를까지 내가 계속 홍조s의 순환에서 제거.
2. 혈관 계통에 캐스팅 에이전트의 재관류
- 믹스 필터링 MV 화합물 4 ML과 함께 뮤직 비디오 희석제 5 ML : Microfil (흐름 테크 주식 회사 카버, MA) 제조 업체의 절차에 따라 주조 솔루션을 준비합니다. 촉매의 450μl를 (5 %) (MV 양생 에이전트) 추가합니다. 솔루션 작동 시간은 20 분,하지만 적절한 점도를 보장하기 위해 사용하기 전에 바로 섞는다.
- 10ml의 주사기에 에이전트 솔루션을 주조 철회, 주사기에 뭉툭한 20 게이지 바늘을 첨부하고 솔루션 바늘을 입력합니다.
- 혈액을 꼴이지에 사용된 것과 같은 구멍을 통해 좌심실에 바늘을 삽입합니다. 심장에 hemostat 클램프와 장소에 보안 바늘.
- 약 3 ML / 분 천천히 좌심실로 캐스팅 에이전트 솔루션을 주사. 초과 압력 주조 대리인 또는 잠재적인 선박 파열의 잘못된 흐름으로 이어질 수 있습니다.
- 를 포함하여 성공적인 재관류의 흔적에 대한 봐요 : 주조의 시각화대장 및 간 vasculature, 말초 사지 변색, 그리고 코, 혀 변색의 ING 에이전트. 필요한 적절한 재관류를 달성하는 경우에는 주사를 정리하다.
3. 수집 및 조직의 처리
- 4 박 4 % paraformaldehyde에 두뇌 및 장소를 제거 ° C.
- 직접 상온에서 점점 더 집중 EtOH로 paraformaldehyde의 배치에 의해 머리를 탈수 : 25 % EtOH, 일일, 50% EtOH, 일일, 75% EtOH, 일일, 95% EtOH 2 일, 100 % EtOH 2 일 .
- 상온에서 2 일간 메틸 살리실산의 perfused 머리를 immersing하여 혈관 주위 뇌 조직을 명확히하십시오.
- 전체 unsectioned 명확히 두뇌의 Vasculature은 해부 현미경 (그림 1) (Leica MZFL III 현미경, Leica 마이크로 시스템즈, Bannockburn, IL) 또는 brightfield 현미경 (그림 2) (Leica DM / 아래 메틸 살리실산에 포장되어 두뇌와 몇 군데 수 있습니다 LS, Leica 마이크로 시스템즈).
- Reclarification조직이 완전히 지워되지 않은 경우 수행할 수 있습니다. 메틸 살리실산, 전송 두뇌에서 2 일간 95 % EtOH로, 100 2 일간 %의 EtOH, 2 일간 메틸 살리실산.
4. 마이크로 - CT 영상이나 Histological 응용 조직 준비
- 두뇌는 바로 (그림 4) 설명 후 또는 다시 수화 이후 마이크로 - CT를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다.
- ; 95% EtOH, 일일, 75% EtOH, 일일, 50% EtOH 2 일, 25% EtOH 2 일 백퍼센트 EtOH, 1 일 : histological 분석을위한 뇌 조직을 준비하려면, 직렬 희석 EtOH를 통해 머리를 rehydrate , PBS 및 저장합니다. 두뇌는 다음 표준 절차를 사용하여 파라핀에 박혀 수 있습니다.
5. 대표 결과
혈관 캐스팅 후, cerebrovasculature은 뇌의 표면 (Fig.1A)에 macroscopically 볼 수 있습니다. 실질 내부 혈관 트리 (그림 1B를) 다음과 같은 시각 해명하실 수 있습니다. 자세한 혈관 구조몇 군데와 (그림 3) 범위를 해부하고, 마이크로 - CT 스캔 (그림 4), brightfield 현미경 (그림 2)에 따라 분석하실 수 있습니다. brightfield 현미경 사용 vasculature는 높은 배율 (그림 2B)에서 두뇌 (그림 2A)뿐만 아니라 개인 microvessels을 sectioning하지 않고 서로 다른 초점 비행기에서 볼 수 있습니다. 해부 현미경, 하나는 cerebrovasculature의 입체 구조 (그림 3) 더 나은 시각화를 허용 하나의 초점 비행기에서 전체 혈관 구조를 볼 수 있습니다. 해부 현미경으로 촬영한 이미지는 대형 선박 형태 및 전체 뇌 vasculature을 보여주지만, brightfield 현미경 (그림 2B)로 찍은 사진에 표시된 내용을 부족 수 있습니다. 이 기술은 우리가 실험 BAVM 성인 마우스 모델 2 불규칙 혈관을 감지할 수있었습니다. 그림 5는 마이크로 - CT 스캔 (그림의 5A)와 brightfield 현미경 (그림의 5B)에 의해 감지 같은 불규칙한 혈관의 예를 보여줍니다. 함께,이 데이터는 우리가 t을 분석할 수 있습니다 것을 보여줍니다혈관 캐스팅 후 여러 이미징 도구를 사용하여 그 같은 샘플.
그림 1. 혈관 캐스트 다음 전체 마우스 뇌. 전 (A)와 용매 메틸 살리실산에 의해 (B) 허가 이후에. 선박은 뇌의 표면 (A)와 실질 다음과 같은 설명 절차 (B)로 명확하게 시각하실 수 있습니다.
명확히 혈관 casted 두뇌의 그림 2. Brightfield 현미경 이미지. 브레인 다양한 비행기에서 서로 다른 배율 수준에서 몇 군데하실 수 있습니다. 스케일 바 200μm (A) 및 50μm (B).
그림 3. 지느러미보기에서 전체 성인 마우스 뇌 cerebrovasculature를 보여주는 1X에서 현미경 이미지를 분석 해 봅시다.
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그림 4. 마이크로 - CT는 지느러미보기에서 그림 3에 표시된 동일한 전체 성인 마우스 두뇌의 이미지를 스캔.
그림 5. 두뇌 arteriovenous보기 흉한 것을 감지 혈관 주조 방법의 응용 프로그램. A) 혈관 casted 두뇌의 마이크로 CT 촬영은 복부보기에서 오른쪽 반구의 확대, 불규칙 AVM 같은 선박의 영역을 보여줍니다. 지역의 확대 이미지 (화이트 박스)은 오른쪽에 표시됩니다. B) 같은 불규칙한 혈관는 50x 배율에서 brightfield 현미경 아래에서 시각. 스케일 바 50 μm의.
Discussion
우리는 여기서 다양한 modalities와 함께 몇 군데있을 수 있습니다 성인 마우스 cerebrovasculature의 캐스팅에 대한 방법을보고합니다. 질병 모델 BAVM이 방법의 적용이 불규칙 선박의 3D 분석을 수 있습니다. 향후 연구는 마이크로 - CT 이미지의 부량, 조직의 histological 분석 및 혈관 질병 진행의 진단을 포함합니다.
일반적인 문제가있어서 프로그램을 제안
두뇌 vasculature의 완전한 재관류 항상 달성되지 않습니다. 왼쪽 심방이나 대동맥을 rupturing없이 말초 혈관에 도달하기에 충분한 압력을 갖는 것은 도전입니다. 이것을 극복하기 위해 약 100mmHg의 일관된 압력을 적용합니다. 또한, 대동맥에 에이전트를 주조의 적절한 유출을 보장하기 위해 바늘 위치를 조정합니다. 캐스팅 에이전트가 두뇌 혈관에 도달할 수 있도록 경동맥 동맥이 제한하지 않는 것이 중요합니다. 당 향상 작은 용기와 연관 중요 절차융합은 다음과 같습니다 vasculature에서 혈액 (1) 적절한 삭제, 캐스팅 에이전트 (2) 여과 및 캐스팅 에이전트 주입시 (3) 주사 바늘을 배치. 관리는 좌심방과 폐를에 에이전트를 주조의 주입을 피하기 위해 이동해야합니다. 다른 조사가 성공적으로 추가 절차를 사용하지 않고 마우스 3 쥐 4 cerebrovasculature을 perfused있다. hemotoxylin이 93 % 선박 루멘 재관류 5 보였다와 Microfil perfused 선박의 수동 분석 counterstained. 항상 폐기 또는 완전히 신속하게 중합되며, 도구가 여러 과목 사용할 수 없습니다로 캐스팅 에이전트 접촉 어떤 도구를 청소하십시오. 주변 마우스 뇌 조직을 명확 도전하실 수 있습니다. 메틸 살리실산의 침수에 따라 조직은 여전히 선박 이미징이 어렵게 불투명 나타날 수 있습니다. 적절한 탈수와 설명을 보장하는 것은이 문제를 해결한다. 알코올 및 메틸의 동안 로커에서 뇌 조직을 배치alicylate 치료는 조직 해명을 향상시킬 수 있습니다.
기술의 단점
이 기법의 한계는 다음과 같습니다 : (1) 그것은 바로 촉매가 추가 후 신속하게 진하게하므로 그것을 혼합 후 주조 에이전트 솔루션을 주입하는 것이 필요합니다, (2) 주조 에이전트 쉽게 대형 전도성 선박을 가득 채우고 있지만, 그것은하지 않습니다 안정 등 arterioles (저항 선박)과 모세 혈관 (영양 혈관)로 작은 혈관을 작성하며, 일부 단체가 마이크로 - CT 영상 1,6에 대한 Microfil을 선호하지만 (3) 그것은 마이크로 - CT 영상을위한 최고의 radiopaque 명암되지 않습니다. 그러나, 적절한 바늘 배치, 선박 위치 및 재관류 압력을 포함하여 위에 제안된 제안, 다음, 작은 혈관의 완전한 주조가 형성될 수 있습니다. 다양한 분석 도구에 대한 적응성 다양한으로이 에이전트 동맥과 정맥의 혈액 순환을 포함한 뇌혈관 구조를 분석하는 유용한 도구를 만드는관점.
기술의 응용
이 방법의 장점은 광범위한 응용 가능성이 있습니다. 캐스트는 동맥, 정맥, 그리고 신체 내에있는 모든 조직의 모세 혈관 포함한 모든 선박을 채우고, 다양한 종류의 여러 장기에 혈관 구조 분석 수 있도록. 이전에는 다른 그룹은 인간, 원숭이 9, 양 10, 쥐 4,11,12, 마우스 3,13 7 크고 작은 8 선박이 재관류를 사용했습니다. 우리는 지금 건강하고 병에 걸린 두 상태에서 마우스 두뇌 microvessels의 구조를 분석 2이 방법을 사용하는 증거를 보여줍니다. 또한, 여러 장기의 혈관의 시각화을 향상시키기 위해 다양한 크기와 다양한 색상의 혈관을 perfuse 사용 가능한 다양한 viscosities와 Microfil 해결책이 있습니다. 예를 들어, 빨간색은 잘 대조 쉽게 창백한 뇌 실질의 시각, 그리고 노란색 수 있습니다진한 빨간색 myocardium. 자료 radiopaque대로 또한, vasculature는 마이크로 - CT는 3 차원 rotatable 이미지를 얻기 위해 스캔 군데하실 수 있습니다. 조직도 몇 군데 거쳐 파라핀 섹션 및 histological 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
결론
우리는 cerebrovasculature의 형태학의 구조를 연구 분석 기법의 다양한 사용하여 적용할 수 있습니다 성인 마우스 뇌의 혈관의 혈관 캐스트를 만들려고 여기 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 또한 확대, 불규칙 모양의 선박에 의해 대표, BAVM 질환 상태의 모델이 방법의 응용에 대한 증거를 제공한 정맥 순환에 동맥에서 션트 혈액. 사용 가능한 혈관 주조 다양한 방법이 있습니다. 우리는 혈관 캐스트를 보시려면 여기를 제공하는 간단한 프로토콜은 다양한 이미징 modalities를 사용하여 성인 마우스 뇌의 vasculature을 검사하는 도구로 사용할 수 있습니다.
Disclosures
실험 동물을 사용하는 실험 절차가 캘리포니아 대학, 샌프란 시스코 (UCSF)의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
Acknowledgments
저자는 원고의 준비와 지원 볼테르 Gungab 주셔서 감사합니다. 이 작품은의 보조금에 의해 일부 지원되었습니다 H. 스와로 국립 보건원 (T32 GM008440 WL 청년과 H. 스와로 EJ 워커, WL 영에 R01 NS27713, NS44155 P01)를, 그리고 R21 NS070153, 그리고 미국 심장 협회 (AHA H. 스와로 10GRNT3130004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
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