Summary
في هذه المقالة ، نقدم بسيطة ، العملية لتقنية الصب الدماغية التي هي سهلة لتنفيذ ويمكن استخدامها لصورة شجرة والأوعية الدموية للدماغ الفأر الكبار.
Abstract
الأوعية الدموية التصوير حاسما في التشخيص السريري وإدارة الأمراض القلبية الوعائية ، مثل تشوهات الشرايين والأوردة في المخ (BAVMs). النماذج الحيوانية ضرورية لدراسة العلاجات الباثولوجيا السببية والمحتملة من الأمراض الدماغية الوعائية. تصوير الأوعية الدموية في الحيوانات الكبيرة سهلة نسبيا. ومع ذلك ، وتطوير أساليب التصوير السفينة من الفئران نماذج مرض الدماغ هو مرغوب فيه نظرا للتكلفة وتوافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا. تصوير الأوعية الدموية الدماغية الفئران الشجرة هو التحدي. في البشر والحيوانات الكبيرة ، المعيار الذهبي لتقييم angioarchitecture في الأوعية الكبيرة (تصرف) هو مستوى الأشعة السينية القسطرة النقيض القائم على تصوير الأوعية ، وهي طريقة غير مناسبة للقوارض صغيرة.
في هذه المقالة ، نقدم طريقة الصب الدماغية التي تنتج هيكل عظمي دائمة من السرير والأوعية الدموية بأكملها ، بما في ذلك الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية والتي قد تكون تحليلها باستخدام العديد من دifferent الطرائق. يمكن الصب الكامل للmicrovessels من cerebrovasculature الماوس يكون صعبا ، ولكن يتم التصدي لهذه التحديات في هذا البروتوكول خطوة بخطوة. من خلال نضح intracardial المواد الصب الأوعية الدموية ، وجميع السفن مسبوكة من الجسم. ويمكن عندئذ الدماغ يمكن إزالتها وأوضح باستخدام المذيبات العضوية ساليسيلات الميثيل. ويمكن تصوير الأبعاد الثلاثة في الأوعية الدموية في الدماغ تصور ببساطة وغير مكلفة مع أي المجهر brightfield التقليدية أو مجهر تشريح. يمكن أيضا أن تكون مسبوكة cerebrovasculature تصوير وكميا باستخدام التصوير المقطعي الصغيرة (المتناهية الصغر CT) 1. بالإضافة إلى ذلك ، يجري تصويره بعد ، يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ الدماغ مسبوكة في البارافين للتحليل النسيجي.
الاستفادة من هذا الأسلوب الصب الأوعية الدموية بالمقارنة مع غيرها من التقنيات هو التكيف الواسع لأدوات تحليلية مختلفة ، بما في ذلك تحليل brightfield المجهرية ، الفحص بالاشعة المقطعية نظرا لcharac ظليل للأشعةteristic من المواد ، فضلا عن تحليل النسيجي والمناعى. وهذا يمكن أن الاستخدام الفعال للحفظ الأنسجة الحيوانية الاستخدام وتقليل التكاليف. لقد أظهرنا مؤخرا تطبيق هذه الطريقة لتصور الأوعية الدموية الشاذة في نموذج الفأر من BAVM الكبار على المستوى المجهري 2 ، ويقدم صورا إضافية للسفن التي تالف تصوير الاشعة المقطعية المتناهية الصغر. على الرغم من أن هذه الطريقة لها عيوبها ، وربما لا يكون مثاليا لجميع أنواع التحليلات ، بل هو بسيط وتقنية العملية التي يمكن تعلمها بسهولة وتطبيقها على نطاق واسع الصب الأوعية الدموية الأوعية الدموية في جميع أنحاء الجسم.
Protocol
1. تطهير الدم من الأوعية الدموية
- تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين ملغ / كلغ 100 مع زيلازين ملغ / كلغ مخففة في 10 مل المالحة 0.25.
- مرة واحدة وقد تم تأكيد التخدير التي لا استجابة لقرصة مخلب ، استخدم المقص لإجراء شق عبر الصدر مع مقص أقل بقليل من عملية سيفي الشكل ، وقطع طريق الحجاب الحاجز ، وتقطيعها وبين الجزء الظهري البطني من القفص الصدري لكشف التجويف الصدري. كشف القلب بنسبة تصل القص والطي المتاخمة جدار الصدر وآمنة مع مرقئ. فتح كيس التامور مع ملاقط لكشف القلب.
- بدوره على مضخة الارواء (100mmHg الضغط) متصلا الدافئة بالاضافة الى برنامج تلفزيوني الهيبارين (5 وحدة / مل) حل في حمام الماء الساخن عند 37 درجة مئوية ، وأنابيب بإبرة حادة قياس 22 في التدفق.
- ادخال الإبرة في البطين الأيسر ، بالقرب من قمة القلب. قطع على الفور فتح الأذين الأيمن لتمكين تدفق الدم النظامية ويستمر حتى احمرار الدم طق إزالتها من التداول.
2. نضح من وكيل صب في نظام الأوعية الدموية
- إعداد Microfil (تدفق التكنولوجيا ، وشركة كارفر ، ماجستير) في بروتوكول حل الصب الصانع : 5 مل من مزيج مخفف MV مع 4 مل من مجمع MV تصفيتها. إضافة 450μl (5 ٪) من محفز (MV كيل علاج). حل وقت العمل هو 20 دقيقة ، ولكن المزيج على الفور قبل استخدامه للتأكد من اللزوجة المناسبة.
- سحب الصب في حل كيل حقنة 10ML ، أرفق كليلة إبرة قياس 20 إلى المحقنة والإبرة مع ملء الحل.
- ادخال ابرة في البطين الأيسر من خلال ثقب نفسها المستخدمة في التنظيف الدم. إبرة في مكان آمن مع المشبك مرقئ على القلب.
- حقن صب حل كيل ببطء في البطين الأيسر بحوالي 3 مل / دقيقة. الضغط الزائد قد يؤدي إلى تدفق غير صحيح من وكيل صب أو المحتملة تمزق السفينة.
- ابحث عن علامات نضح ناجحة ، بما في ذلك : تصور من الزهرجي وكيل في الأوعية الدموية الأمعاء والكبد ، تلون أطرافه البعيدة ، والأنف وتلون اللسان. تعدل الإبرة إذا لزم الأمر لتحقيق التروية المناسبة.
3. جمع ومعالجة الأنسجة
- إزالة الدماغ ومكانته في بارافورمالدهيد 4 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- يذوى من الدماغ عن طريق وضع بارافورمالدهيد مباشرة في EtOH تتركز بشكل متزايد في درجة حرارة الغرفة : 25 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 50 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 75 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 95 ٪ EtOH ، 2 أيام ، و 100 ٪ EtOH ، 2 أيام .
- توضيح حول أنسجة المخ الأوعية الدموية في الدماغ عن طريق غمر perfused في ساليسيلات الميثيل لمدة 2 يوما في درجة حرارة الغرفة.
- ولا يمكن تصوير الأوعية الدموية للدماغ unsectioned كامل مع توضيح الدماغ منغمسين في ساليسيلات الميثيل تحت المجهر تشريح (الشكل 1) (لايكا الثالث MZFL المجهر ، لايكا مايكروسيستمز ، بانوكبورن ، IL) أو brightfield المجهر (الشكل 2) (لايكا DM / LS ، لايكا مايكروسيستمز).
- Reclarificationويمكن أن يتم إذا لم يتم تطهير الأنسجة تماما. من ساليسيلات الميثيل في الدماغ نقل على EtOH 95 ٪ لمدة 2 يوما ، و 100 ٪ للEtOH 2 أيام ، وساليسيلات الميثيل لمدة 2 ايام.
4. الجزئي أو التصوير المقطعي النسيجية إعداد التطبيق النسيج
- ولا يمكن تصوير الدماغ باستخدام التصوير المقطعي الصغيرة مباشرة بعد توضيح أو بعد إعادة الترطيب (الشكل 4).
- لإعداد أنسجة المخ للتحليل النسيجي ، ترطيب الدماغ من خلال المسلسل EtOH المخفف : 100 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 95 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 75 ٪ EtOH ، 1 اليوم ، 50 ٪ EtOH ، 2 أيام ، 25 ٪ EtOH ، 2 أيام ؛ وتخزينها في برنامج تلفزيوني. ثم يمكن للدماغ أن يكون جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام إجراء القياسية.
5. ممثل النتائج
بعد الصب الأوعية الدموية ، ويمكن أن ينظر إلى cerebrovasculature ظاهريا على سطح الدماغ (Fig.1A). يمكن للشجرة الأوعية الدموية داخل لحمة يمكن تصور التوضيح التالي (الشكل 1B). الهيكل التفصيلي الأوعية الدمويةولا يمكن تصوير وتحليل تحت المجهر brightfield (الشكل 2) ، وتشريح النطاق (الشكل 3) ، والجزئي مع الفحص بالاشعة المقطعية (الشكل 4). باستخدام المجهر brightfield ، يمكن أن ينظر إلى الأوعية الدموية في طائرات مختلفة دون التنسيق sectioning الدماغ (الشكل 2A) ، وكذلك microvessels الفردية على أعلى التكبير (الشكل 2B). تحت نطاق تشريح ، يمكن للمرء أن يرى الهيكل بأكمله الأوعية الدموية في طائرة واحدة محورية ، مما يتيح أفضل تصور للهيكل الأبعاد الثلاثة للcerebrovasculature (الشكل 3). يمكن أن الصور الملتقطة تحت المجهر تشريح تظهر كبيرة التشكل السفينة والأوعية الدموية في الدماغ كله ، ولكن تفتقر إلى التفاصيل المبينة في الصور التي التقطت مع المجهري brightfield (الشكل 2B). وقد سمحت لنا هذه التقنية للكشف عن السفن غير النظامية في نموذجنا BAVM التجريبية الماوس الكبار 2. ويبين الشكل 5 مثال على السفن غير النظامية نفسه الكشف عنها بواسطة الفحص بالاشعة المقطعية المتناهية الصغر (الشكل 5A) وbrightfield المجهر (الشكل 5B). معا ، وهذه البيانات يدل على أننا يمكن تحليل رانه نموذج واحد مع أدوات التصوير متعددة بعد الصب الأوعية الدموية.
الشكل 1. الجامع مخ الفأر التالية الصب الأوعية الدموية. قبل (A) وبعد (B) ساليسيلات الميثيل توضيحا من المذيبات. ويمكن تصور أن تكون السفن بوضوح على سطح الدماغ (A) وحمة الداخلي التوضيح التالي (B).
الرقم 2 Brightfield المجهر. صور الأوعية الدموية في الدماغ توضيح مسبوكة. ولا يمكن تصوير الدماغ على طائرات مختلفة وعلى مستويات مختلفة التكبير. جدول المحامين 200μm (A) و50μm (B).
الشكل 3. تشريح المجهر في صورة تظهر 1X كله مخ الفأر cerebrovasculature الكبار من وجهة نظر الظهرية.
<img وALT = "الشكل 4" SRC = "/ files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg" />
الشكل 4. الصغرى ، الفحص بالاشعة المقطعية صورة نفسه كاملة الكبار مخ الفأر هو مبين في الشكل (3) من وجهة نظر الظهرية.
الشكل 5. تطبيق طريقة الصب الأوعية الدموية للكشف عن تشوه شرياني والدماغ. أ) الصغرى ، الأشعة المقطعية للدماغ الوعائية محمل يظهر منطقة الموسع ، AVM السفن مثل عدم انتظام في النصف الأيمن من وجهة نظر البطني. يظهر صورة مكبرة من المنطقة (المربع الأبيض) على اليمين. ب) تصور السفن غير النظامية نفسه تحت المجهر على التكبير 50x brightfield. مقياس شريط 50 ميكرون.
Discussion
نحن هنا التقرير وسيلة لصب cerebrovasculature الماوس الكبار التي قد تكون تصوير مع طرائق مختلفة. تطبيق هذا الأسلوب لهذا المرض BAVM نموذج يتيح تحليل 3D السفن غير النظامية. الدراسات المستقبلية المحتملة تشمل تقدير حجم الصور المقطعية الدقيقة والتحليل النسيجي للنسيج ، وتشخيص تطور المرض في الأوعية الدموية.
واجهت مشاكل مشتركة واقتراحات
ليس نضح كاملة من الأوعية الدموية في الدماغ يتحقق دائما. وجود ما يكفي من الضغط للوصول إلى الأوعية الدموية الطرفية دون تمزق الأذين الأيسر أو الأبهر هو التحدي. للتغلب على هذا ، والضغط ثابت من 100mmHg تقريبا. أيضا ، وضبط الموقف الإبرة لضمان تدفق مناسب من وكيل صب في الشريان الأورطي. من المهم أن لا تقتصر على الشرايين السباتية بحيث يمكن أن تصل إلى وكيل صب في الأوعية الدماغية. الحرجة الإجراءات التي ترتبط مع تحسن في إناء صغيرالانصهار هي : (1) تبادل المعلومات المناسبة من الدم من الأوعية الدموية ، (2) ترشيح وكيل الصب ، و (3) موضع إبرة الحقن خلال وكيل الصب. وينبغي الحرص على تجنب حقن صب وكيل في الأذين الأيسر والرئة. وقد perfused محققين آخرين بنجاح الماوس 3 و 4 cerebrovasculature الفئران بدون استخدام إجراءات إضافية. counterstained التحليل اليدوي للسفن perfused Microfil مع hemotoxylin أظهرت 93 ٪ نضح تجويف السفينة 5. تجاهل دائما نظيفة تماما أو أي أداة الذي يأتي في اتصال مع وكيل صب لأنها سوف تتبلمر بسرعة ، ولا يمكن أن تكون الأدوات المستخدمة في مواضيع متعددة. ويمكن توضيح الأنسجة المحيطة دماغ الفأر تكون صعبة. بعد الانغماس في ساليسيلات الميثيل ، قد يبدو ما زالت مبهمة الأنسجة ، مما يجعل من الصعب تصوير السفينة. وينبغي ضمان الجفاف سليم وتوضيح حل هذه المشكلة. وضع أنسجة المخ على الكرسي الهزاز خلال ليالي والكحول الميثيلويمكن تحسين العلاج alicylate توضيح الأنسجة.
عيوب تقنية
قيود هذا الأسلوب ما يلي : (1) من الضروري حقن صب وكيل حل مباشرة بعد خلطها لأنها سوف رشاقته بسرعة بعد إضافة الحافز ، (2) وكيل صب يملأ السفن الكبيرة تصرف بسهولة ، ولكنه لا ملء موثوق السفن الصغيرة ، مثل الشرايين (الأوعية المقاومة) والشعيرات الدموية (الأوعية المغذية) ، و (3) ليس هذا هو النقيض لأفضل ظليل للأشعة المقطعية الدقيقة والتصوير ، وعلى الرغم من أن بعض المجموعات تفضل Microfil عن التصوير المقطعي الصغيرة 1،6. ومع ذلك ، وفقا لاقتراحات المقترحة أعلاه ، بما في ذلك وضع الإبرة الصحيح ، موقف السفينة وضغط التروية ، لا يمكن تحقيق الصب كاملة من السفن الصغيرة. والقدرة على التكيف مع مختلف أدوات التحليل يجعل هذا العامل أداة قيمة لتحليل البنية الدماغية ، بما في ذلك تداول الشرايين والأوردة ، مع مختلفوجهات النظر.
تطبيقات تقنية
الاستفادة من هذا الأسلوب هو إمكاناتها تطبيق واسع النطاق. المدلى بها تملأ جميع السفن ، بما في ذلك الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية ، وجميع الأنسجة داخل الجسم ، بحيث يمكن تحليل هياكل الأوعية الدموية في الأجهزة متعددة من مختلف الأنواع. سابقا ، وقد استخدمت هذه الجماعات الأخرى نضح للسفن الكبيرة 8 7 و الصغيرة في الإنسان ، والقرد 9 ، 10 الغنم ، 4،11،12 الفئران ، والفأر 3،13. نعرض الآن أدلة على استخدام هذه التقنية في تحليل بنية microvessels في مخ الفأر ، في ولايات كل من سليم والمريضة 2. بالإضافة إلى ذلك ، هناك حلول Microfil مع اللزوجة المختلفة المتاحة ليروي سفن من مختلف الأحجام والألوان المختلفة لتحسين التصور للسفن في الأجهزة المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون أحمر بسهولة في الدماغ حمة شاحب ، ويتناقض تماما مع الأصفرالأحمر الداكن عضلة القلب. وعلاوة على ذلك ، حيث أن المواد غير ظليل للأشعة ، ويمكن تصوير الأوعية الدموية الصغيرة مع الفحص بالاشعة المقطعية للحصول على صورة 3D للتدوير. ويمكن أيضا أن تستخدم في النسيج لأقسام البارافين والتحليل النسيجي بعد التي يجري تصويرها.
اختتام
ندلل هنا على بروتوكول لجعل المدلى بها الأوعية الدموية في الأوعية الدموية للدماغ الفأر الكبار ، والتي يمكن تكييفها باستخدام مجموعة متنوعة من تقنيات التحليل لدراسة البنية المورفولوجية للcerebrovasculature. قدمنا أيضا أدلة لتطبيق هذا الأسلوب لنموذج الدولة BAVM المرض ، ويمثلها السفن ، غير منتظمة الشكل الموسع أن الدم الشرياني لتحويلة من التداولات وريدي. وهناك مجموعة متنوعة من الأساليب المتاحة الصب الأوعية الدموية. ويمكن استخدام بروتوكول بسيطة نقدمها هنا ليلقي الأوعية الدموية كوسيلة لفحص الأوعية الدموية للدماغ الفأر البالغين باستخدام طرق التصوير المختلفة.
Disclosures
تمت الموافقة على إجراءات تجريبية لاستخدام الحيوانات المختبرية من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة استخدم من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (UCSF).
Acknowledgments
الكتاب أشكر فولتير Gungab للحصول على المساعدة في إعداد المخطوط. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من : المعاهد الوطنية للصحة (T32 GM008440 EJ لوكر ، R01 NS27713 ليونج WL ، P01 NS44155 ليونغ سو وWL ه) ، وR21 NS070153 سو لحاء ؛ والأمريكي جمعية القلب (AHA 10GRNT3130004 سو لحاء).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
References
- Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs. Bone. 43, 195-202 (2008).
- Walker, E. J. Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease. Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).
- Iqbal, U. Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).
- Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat. 145, 473-480 (2003).
- Chugh, B. P. Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography. Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. ainey, L, L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).
- Fossett, D. T., Caputy, A. J. Operative Neurosurgical Anatomy. , Thieme Medical Publishers. New York. (2002).
- Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta). Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).
- Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).
- Brady, J. M., Cutright, D. E. A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat. Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).
- Evan, A. P., Dail, W. G. Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney. Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
