Summary
इस अनुच्छेद में, हम एक सरल, cerebrovascular ढलाई के लिए व्यावहारिक तकनीक है कि प्रदर्शन करने के लिए आसान है और वयस्क माउस मस्तिष्क के संवहनी पेड़ की छवि के लिए उपयोग किया जा सकता उपस्थित थे.
Protocol
1. Vasculature से रक्त क्लियरिंग
- 10 मिलीग्राम / किग्रा 0.25 मिलीलीटर खारा में पतला xylazine के साथ 100 मिलीग्राम / किग्रा ketamine के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize.
- एक बार एक पंजा चुटकी करने के लिए कोई जवाब नहीं संज्ञाहरण के द्वारा पुष्टि की गई है, कैंची का उपयोग करने के लिए सीने के पार बस xyphoid प्रक्रिया के नीचे कैंची, डायाफ्राम के माध्यम से काट के साथ एक चीरा बनाने, और वक्ष गुहा का पर्दाफाश करने के लिए ribcage के पृष्ठीय और ventral खंड के बीच में कटौती. उरोस्थि और आसन्न छाती दीवार तह और hemostat के साथ सुरक्षित दिल बेनकाब. चिमटी के साथ pericardial थैली दिल को बेनकाब करने के लिए खोलें.
- छिड़काव पंप (दबाव 100mmHg) पीबीएस प्लस हेपरिन (5 इकाई / एमएल) गर्म पानी से स्नान में 37 बजे समाधान डिग्री सेल्सियस और एक कुंद बहिर्वाह पर 22 गेज सुई के साथ टयूबिंग. गर्म जुड़ा पर मुड़ें
- बाएं वेंट्रिकल में दिल के शीर्ष के पास सुई, सम्मिलित करें. तुरंत खोलने सही atrium में कटौती के लिए प्रणालीगत रक्त बहिर्वाह सक्षम और निस्तब्धता जारी जब तक मैं रक्तसंचलन से हटा दिया है.
2. कास्टिंग एजेंट के संवहनी प्रणाली में छिड़काव
- फ़िल्टर एमवी परिसर के 4 मिलीलीटर के साथ एमवी मंदक के मिक्स 5 मिलीलीटर (फ्लो टेक, Inc Carver, एमए): निर्माता प्रोटोकॉल प्रति कास्टिंग समाधान Microfil तैयार. उत्प्रेरक (5%) 450μl (एमवी इलाज एजेंट) जोड़ें. समाधान काम कर समय 20 मिनट है, लेकिन तुरंत मिश्रण से पहले उचित चिपचिपापन सुनिश्चित करने के लिए उपयोग.
- एक 10ml सिरिंज में एजेंट समाधान कास्टिंग वापस लेने, सिरिंज एक कुंद 20 गेज सुई देते हैं और समाधान के साथ सुई भरें.
- बाएं वेंट्रिकल में एक ही रक्त निस्तब्धता के लिए इस्तेमाल किया छेद के माध्यम से सुई डालें. दिल पर hemostat क्लैंप के साथ जगह में सुरक्षित सुई.
- बाएं वेंट्रिकल में धीरे - धीरे लगभग 3 मिलीग्राम / मिनट में कास्टिंग एजेंट समाधान इंजेक्षन. अतिरिक्त दबाव कास्टिंग एजेंट या संभावित पोत टूटना गलत प्रवाह करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
- सफल छिड़काव सहित लक्षण, के लिए देखो: कलाकारों के दृश्यआंत और यकृत vasculature, बाहर का अंग मलिनकिरण, और नाक और जीभ मलिनकिरण में आईएनजी एजेंट. यदि आवश्यक उचित छिड़काव प्राप्त करने के लिए सुई का मरम्मत करना.
3. संग्रह और ऊतक के प्रसंस्करण
- मस्तिष्क और 4% paraformaldehyde में जगह 4 रातोंरात निकालें डिग्री सेल्सियस
- निर्जलीकरण paraformaldehyde से सीधे कमरे के तापमान पर तेजी से ध्यान केंद्रित EtOH में रखकर मस्तिष्क: 25% EtOH, 1 दिन, 50% EtOH, 1 दिन, 75% EtOH, 1 दिन, 95% EtOH, 2 दिन, और 100% EtOH, 2 दिन .
- मिथाइल सैलिसिलेट में 2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर perfused मस्तिष्क डुबो कर रक्त वाहिकाओं के आसपास मस्तिष्क के ऊतकों को स्पष्ट.
- पूरे unsectioned स्पष्ट मस्तिष्क की vasculature मिथाइल सैलिसिलेट में डूबे एक विदारक सूक्ष्मदर्शी (छवि 1) (Leica MZFL III माइक्रोस्कोप, Leica माइक्रोसिस्टम्स, Bannockburn, आईएल) या brightfield खुर्दबीन (छवि 2) (Leica डीएम / के तहत मस्तिष्क के साथ imaged किया जा सकता है रास, Leica माइक्रोसिस्टम्स).
- Reclarificationअगर ऊतक पूरी तरह से नहीं मंजूरी दे दी है किया जा सकता है. मिथाइल सैलिसिलेट हस्तांतरण मस्तिष्क से 2 दिनों के लिए 95% EtOH 2 दिनों के लिए 100% EtOH, और 2 दिनों के लिए मिथाइल सैलिसिलेट.
4. माइक्रो - सीटी इमेजिंग या histological अनुप्रयोग ऊतक तैयार
- मस्तिष्क स्पष्टीकरण के बाद सीधे या पुनः जलयोजन के बाद (4 छवि) सूक्ष्म सीटी का उपयोग imaged किया जा सकता है.
- Histological विश्लेषण के लिए मस्तिष्क के ऊतकों को तैयार करने के लिए, धारावाहिक पतला EtOH के माध्यम से मस्तिष्क rehydrate EtOH, 95%, 1 दिन, 75% EtOH, 1 दिन, 50% EtOH, 2 दिन, 25% EtOH, 2 दिन 100% EtOH, 1 दिन: पीबीएस में दुकान और. मस्तिष्क तो एक मानक प्रक्रिया का उपयोग कर आयल में एम्बेडेड जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
संवहनी कास्टिंग के बाद, cerebrovasculature मस्तिष्क की सतह (Fig.1A) पर हो macroscopically देखा जा सकता है. पैरेन्काइमा अंदर संवहनी पेड़ कल्पना निम्नलिखित स्पष्टीकरण हो सकते हैं (छवि 1B). विस्तृत संवहनी संरचनाimaged किया जा सकता है और एक brightfield माइक्रोस्कोप (छवि 2) के तहत विश्लेषण गुंजाइश विदारक (छवि 3), और सूक्ष्म सीटी स्कैनिंग (4 छवि) के साथ. Brightfield माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, vasculature उच्च आवर्धन (छवि 2B) में (छवि 2A) मस्तिष्क के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत microvessels सेक्शनिंग बिना विभिन्न फोकल विमानों पर देखा जा सकता है. एक विदारक गुंजाइश के तहत, एक एक नाभीय विमान में पूरे संवहनी संरचना देखते हैं, cerebrovasculature के तीन आयामी संरचना (3 छवि) के बेहतर दृश्य की अनुमति कर सकते हैं. एक विदारक खुर्दबीन के नीचे लिया छवियाँ बड़े पोत आकारिकी और पूरे मस्तिष्क vasculature दिखा सकते हैं, लेकिन brightfield माइक्रोस्कोपी (छवि 2B) के साथ ली गई तस्वीरों में दिखाया विवरण की कमी है. इस तकनीक हमें हमारे प्रयोगात्मक BAVM वयस्क माउस 2 मॉडल में अनियमित जहाजों का पता लगाने के लिए अनुमति दी गई है. 5 चित्रा एक ही अनियमित सूक्ष्म सीटी स्कैनिंग (छवि 5A) और brightfield खुर्दबीन (छवि 5B) द्वारा पता लगाया वाहिकाओं के एक उदाहरण से पता चलता है. साथ में, इस डेटा से पता चलता है कि हम टी का विश्लेषण कर सकते हैंवह संवहनी कास्टिंग के बाद कई इमेजिंग उपकरणों के साथ एक ही नमूना है.
चित्रा 1 पूरे माउस निम्नलिखित मस्तिष्क संवहनी कास्टिंग. इससे पहले कि (ए) और (बी) मिथाइल विलायक सैलिसिलेट द्वारा स्पष्टीकरण के बाद. वेसल्स मस्तिष्क की सतह (एक) और पैरेन्काइमा निम्नलिखित स्पष्टीकरण प्रक्रिया (बी) में स्पष्ट रूप से कल्पना की जा सकता है.
चित्रा स्पष्ट संवहनी casted मस्तिष्क के 2. Brightfield माइक्रोस्कोप छवियों. मस्तिष्क के विभिन्न विमानों पर और अलग आवर्धन स्तर पर imaged किया जा सकता है. स्केलपट्टी (ए) 200μm 50μm और (बी).
चित्रा 3 1x पर माइक्रोस्कोप छवि विदारक एक पृष्ठीय दृश्य से पूरे वयस्क माउस मस्तिष्क cerebrovasculature दिखा.
<img alt = "चित्रा 4" src = "files/ftp_upload/2958/2958fig4.jpg /" />
चित्रा 4. माइक्रो सीटी ही पूरे वयस्क माउस एक पृष्ठीय दृश्य से चित्रा 3 में दिखाया गया है मस्तिष्क की छवि स्कैनिंग.
चित्रा 5 संवहनी कास्टिंग विधि एक मस्तिष्क arteriovenous कुरूपता का पता लगाने के लिए आवेदन. ए) संवहनी casted मस्तिष्क के माइक्रो - सीटी स्कैन बढ़े, एक वेंट्रल दृश्य से अनियमित एवीएम की तरह दाएँ गोलार्द्ध में जहाजों के क्षेत्र से पता चलता है. क्षेत्र के बढ़े हुए छवि (सफेद बॉक्स) सही पर दिखाया गया है. बी) के समान अनियमित वाहिकाओं 50x बढ़ाई brightfield खुर्दबीन के नीचे कल्पना. स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी.
Discussion
हम यहाँ वयस्क माउस cerebrovasculature है कि विभिन्न तौर तरीकों के साथ imaged किया जा सकता है की कास्टिंग के लिए एक विधि रिपोर्ट. इस विधि के रोग मॉडल BAVM के लिए आवेदन अनियमित वाहिकाओं के 3 डी विश्लेषण सक्षम बनाता है. संभावित भविष्य के अध्ययन सूक्ष्म सीटी छवियों की मात्रा का ठहराव, ऊतक के histological विश्लेषण, और संवहनी रोग प्रगति के निदान शामिल हैं.
आम समस्याओं का सामना करना पड़ा और सुझाव
मस्तिष्क vasculature की पूरी छिड़काव हमेशा नहीं हासिल की है. बाएं आलिंद या महाधमनी rupturing के बिना बाहर रक्त वाहिकाओं तक पहुँचने के लिए पर्याप्त दबाव के बाद एक चुनौती है. इस पर काबू पाने के लिए, लगभग 100mmHg के अनुरूप दबाव लागू होते हैं. इसके अलावा, महाधमनी में कास्टिंग एजेंट के उपयुक्त बहिर्वाह सुनिश्चित करने के लिए सुई की स्थिति को समायोजित. यह महत्वपूर्ण है कि मन्या धमनियों ताकि कास्टिंग एजेंट मस्तिष्क वाहिकाओं तक पहुँच सकते हैं सीमित नहीं हैं. क्रिटिकल प्रक्रियाओं है कि सुधार के प्रति छोटे पोत के साथ सहसंबंधी(1) vasculature से रक्त के उचित समाशोधन, कास्टिंग एजेंट छानने का काम (2), और (3) कास्टिंग एजेंट इंजेक्शन के दौरान सुई प्लेसमेंट: संलयन हैं. ध्यान बाएं आलिंद और फेफड़ों में कास्टिंग एजेंट के इंजेक्शन से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. अन्य जांचकर्ताओं को सफलतापूर्वक अतिरिक्त प्रक्रियाओं का उपयोग कर के बिना 3 माउस और चूहा 4 cerebrovasculature perfused. Microfil perfused वाहिकाओं के मैनुअल विश्लेषण counterstained साथ hemotoxylin 93% पोत लुमेन 5 छिड़काव से पता चला है. हमेशा त्यागने या पूरी तरह से किसी भी उपकरण है कि कास्टिंग एजेंट के साथ संपर्क में आता है के रूप में यह भाजन करना जल्दी है, और उपकरण कई विषयों के लिए नहीं किया जा सकता साफ. आसपास के माउस मस्तिष्क के ऊतकों के स्पष्टीकरण चुनौतीपूर्ण हो सकता है. मिथाइल सैलिसिलेट में विसर्जन के बाद, ऊतक अभी भी अपारदर्शी दिखाई देते हैं, पोत इमेजिंग मुश्किल बना. उचित निर्जलीकरण और स्पष्टीकरण सुनिश्चित करना इस समस्या को हल करना चाहिए. एक झूली कुरसी पर शराब और मिथाइल के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों रखकरalicylate उपचार ऊतक स्पष्टीकरण में सुधार कर सकते हैं.
तकनीक की कमियां
इस तकनीक की सीमाओं में शामिल हैं: (1) यह आवश्यक है के तुरंत बाद यह मिश्रण के रूप में इसे जल्दी से और अधिक मोटा होना के बाद उत्प्रेरक जोड़ा जाता है कास्टिंग एजेंट समाधान इंजेक्षन, (2) कास्टिंग एजेंट बड़े प्रवाहकत्त्व जहाजों को आसानी से भर जाता है, लेकिन यह नहीं मज़बूती arterioles (प्रतिरोध वाहिकाओं) और capillaries (पोषक वाहिकाओं) के रूप में छोटे जहाजों को भरने, और (3) सूक्ष्म सीटी इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा radiopaque विपरीत नहीं है, हालांकि कुछ समूहों Microfil सूक्ष्म सीटी इमेजिंग 1,6 के लिए पसंद करते हैं. हालांकि, ऊपर प्रस्तावित उचित सुई प्लेसमेंट पोत स्थिति और छिड़काव दबाव सहित सुझाव, निम्नलिखित छोटे जहाजों की पूरी कास्टिंग हासिल किया जा सकता है. विभिन्न विश्लेषण उपकरणों के लिए अनुकूलन क्षमता इस धमनी और शिरापरक परिसंचरण सहित cerebrovascular संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के साथ विभिन्न एजेंट बनाता है,दृष्टिकोण.
तकनीक के आवेदन
इस विधि के लाभ के अपने व्यापक आवेदन संभावित है. डाली धमनियों, नसों, और शरीर के भीतर सभी ऊतक के capillaries सहित सभी जहाजों, भरता है, इसलिए, विभिन्न प्रजातियों के कई अंगों में संवहनी संरचनाओं का विश्लेषण किया जा सकता है. इससे पहले, अन्य समूहों के 7 बड़े और छोटे मानव, बंदर 9, 10 भेड़, 4,11,12 चूहे, और माउस 3,13 में 8 जहाजों के लिए इस छिड़काव का इस्तेमाल किया है. अब हम माउस मस्तिष्क में microvessels की संरचना के विश्लेषण में इस तकनीक का उपयोग, दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में 2 के सबूत दिखा . इसके अलावा, वहाँ विभिन्न विभिन्न अंगों में जहाजों के दृश्य में सुधार के लिए विभिन्न आकारों और विभिन्न रंगों के जहाजों छिड़कना उपलब्ध viscosities के साथ Microfil समाधान कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, लाल पीला मस्तिष्क पैरेन्काइमा में आसानी से कल्पना की है, और पीले हो सकता है के साथ अच्छी तरह से विरोधाभासोंगहरे लाल मायोकार्डियम. इसके अलावा, के रूप में सामग्री radiopaque है, vasculature सूक्ष्म सीटी के लिए एक 3 डी rotatable छवि प्राप्त स्कैनिंग के साथ imaged किया जा सकता है. ऊतक भी किया जा रहा है imaged के बाद आयल वर्गों और histological विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
निष्कर्ष
हम यहाँ एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए वयस्क माउस मस्तिष्क, जो cerebrovasculature के morphological संरचना का अध्ययन विश्लेषण तकनीक की एक किस्म का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है की रक्त वाहिकाओं के एक संवहनी डाली. हम भी BAVM रोग राज्य के एक मॉडल के लिए इस विधि के आवेदन के लिए साक्ष्य प्रदान, बढ़े, अनियमित आकार के जहाजों द्वारा प्रतिनिधित्व है कि शिरापरक परिसंचरणों के लिए धमनी से अलग धकेलना रक्त. वहाँ संवहनी कास्टिंग उपलब्ध तरीकों की एक किस्म है. सरल प्रोटोकॉल हम एक संवहनी कलाकारों के लिए यहाँ उपलब्ध कराने के एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है वयस्क माउस मस्तिष्क के विभिन्न इमेजिंग रूपात्मकता का उपयोग vasculature की जांच.
Disclosures
प्रयोगशाला पशुओं का उपयोग करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रिया संस्थागत पशु देखभाल और कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को (UCSF) का प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
Acknowledgments
लेखकों पांडुलिपि तैयारी के साथ सहायता के लिए वॉल्टेअर Gungab धन्यवाद. इस काम के हिस्से में से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (T32 GM008440 EJ वाकर, R01 WL युवा करने के लिए NS27713, P01 WL युवा और एच. र NS44155), एच. र और NS070153 R21, और अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन (अहा एच. र के लिए 10GRNT3130004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microfil | FlowTech | MV130 | 4 month shelf life |
| Methyl Salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | to clarify tissue |
References
- Bolland, B. J., Kanczler, J. M., Dunlop, D. G., Oreffo, R. O. Development of in vivo muCT evaluation of neovascularisation in tissue engineered bone constructs. Bone. 43, 195-202 (2008).
- Walker, E. J. Arteriovenous malformation in the adult mouse brain resembling the human disease. Ann. Neurol. , Forthcoming (2011).
- Iqbal, U. Kinetic analysis of novel mono- and multivalent VHH-fragments and their application for molecular imaging of brain tumours. Br. J. Pharmacol. 160, 1016-1028 (2010).
- Fukunaga, A., Kawase, T., Uchida, K. Functional recovery after simultaneous transplantation with neuro-epithelial stem cells and adjacent mesenchymal tissues into infarcted rat. 145, 473-480 (2003).
- Chugh, B. P. Measurement of cerebral blood volume in mouse brain regions using micro-computed tomography. Neuroimage. 47, 1312-1318 (2009).
- Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
- Barger, A. C., Beeuwkes, R., 3rd, L. ainey, L, L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. N. Engl. J. Med. 310, 175-177 (1984).
- Fossett, D. T., Caputy, A. J. Operative Neurosurgical Anatomy. , Thieme Medical Publishers. New York. (2002).
- Reynolds, D. G., Brim, J., Sheehy, T. W. The vascular architecture of the small intestinal mucosa of the monkey (Macaca mulatta). Anat. Rec. 159, 211-218 (1967).
- Bernard, S., Luchtel, D. L., Polissar, N., Hlastala, M. P., Lakshminarayan, S. Structure and size of bronchopulmonary anastomoses in sheep lung. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 286, 804-813 (2005).
- Brady, J. M., Cutright, D. E. A new technique of measuring blood vessel volume in bone applied to the mandible and humerus of the rat. Anat. Rec. 170, 143-146 (1971).
- Evan, A. P., Dail, W. G. Efferent arterioles in the cortex of the rat kidney. Anat. Rec. 187, 135-145 (1977).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
