Summary
Testa protein-protein interaktion är nödvändig för dissekering av proteiner fungerar. Här presenterar vi ett
Abstract
Validering av interaktioner mellan olika proteiner är avgörande för undersökning av deras biologiska funktioner på molekylär nivå. Det finns flera metoder, både in vitro och in vivo, för att utvärdera proteinbindning, och åtminstone två metoder som kompletterar bristerna i varandra bör genomföras för att få tillförlitliga insikter.
För en in vivo, representerar bimolecular fluorescens komplettering (BiFC assay) de mest populära och minst invasiva metoden som gör det möjligt att upptäcka protein-protein växelverkan i levande celler, samt identifiera de intracellulära lokaliseringen av de interagerande proteiner 1,2. I denna analys, är icke-fluorescerande N-och C-terminal halvor av GFP eller dess varianter smält att testas proteiner, och när de två fusionsproteiner förs samman på grund av de testade proteiner "interaktion är fluorescerande signal färdigberedda 3-6 . Eftersom dess signal är lätt upptäckas med epifluorescence eller konfokalmikroskopi har BiFC framträtt som ett kraftfullt verktyg att välja bland cell biologer för att studera om protein-protein interaktioner i levande celler 3. Denna analys kan dock ibland ge falskt positiva resultat. Till exempel kan den fluorescerande signalen beredas av två GFP fragment ordnas så långt som 7 nm från varandra på grund av nära packning i en liten subcellulära fack, utan att på grund av specifika interaktioner 7.
På grund av dessa begränsningar bör de resultat som erhållits från levande teknik cell imaging bekräftas av en oberoende strategi som bygger på en annan princip för att upptäcka proteininteraktioner. Co-immunoprecipitation (Co-IP) eller glutationtransferas (GST) pull-down-analyser representerar sådana alternativa metoder som allmänt används för att analysera protein-protein interaktioner in vitro. Men Beräkningsgrund för skatt dessa analyser måste dock de testade proteiner vara lättlöslig i den buffert som supportsused för bindande reaktion. Därför kan inga specifika interaktioner mellan ett olösligt protein inte bedömas av dessa tekniker.
Här visar vi protokollet för det protein membran overlay bindande analys, som kringgår denna svårighet. Med denna teknik kan interaktion mellan lösliga och olösliga proteiner på ett tillförlitligt sätt testas eftersom ett av de proteiner som är immobiliserade på ett membran matris. Denna metod i kombination med in vivo-experiment, som BiFC, ger en tillförlitlig metod för att undersöka och karakterisera interaktioner troget mellan lösliga och olösliga proteiner. I denna artikel bindande mellan tobak viruset (TMV) rörelse protein (MP), som utövar flera funktioner under virala cell till cell transporter 8-14, och ett nyligen identifierat anläggning cellulära Interactor, tobak ankyrin upprepa innehåller protein (ANK ) 15, påvisas med denna teknik.
Protocol
1. Uttryck och utvinning av proteiner
- Differentiellt märka proteiner som ska testas för att upptäcka. Märk proteinet ska fixeras på membranet (ProIM) med en tagg av större storlek (t ex moms), och icke kondenserad taggen kan användas som en orörlig negativ kontroll (ProIMnc). Märk proteinet att användas som ett lösligt sond (Prosol) med antingen en stor eller en liten tagg. Säkring samma tagg till en lämplig negativ kontroll lösligt protein (ProSOLnc) och inkluderar i samspelet analysen för att bekräfta specificiteten hos de upptäckta bindande.
- Välj systemet proteinuttryck att uttrycka taggade proteiner, dvs E. coli, baculovirus mm, beroende på krav på potentiella inlägg translationella modifieringar och avkastningen av proteinerna.
- Utdrag ProIM och ProIM nc från organismen val (steg 1,2) med hjälp av SDS-PAGE buffert (20% glycerol, 4% SDS, 20 mM Tris-HCl, pH6.8) som innehåller proteinas hämmare cocktail. Lämna cellsuspension i rumstemperatur i 15 minuter, tillsätt 0,5% av 2-merkaptoetanol och koka i 5 minuter.
- Utdrag Prosol och Prosol nc från organismen val (steg 1,2) med hjälp av ett standardprotokoll 16. Dessa proteiner bör lätt löses upp i bindande buffert (140 mM NaCl, 10 mm, Tris-HCl pH 7,4, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% BSA, 0,1% Tween 20) som används i steg 4,1.
- Bestäm koncentrationen av rekombinanta proteiner med en vanlig metod, t.ex. Bio-Rad protein assay kit. exempelvis Bio-Rad protein assay kit. Om rå extrakt, snarare än renat protein, används för analysen, uppskatta koncentrationen av protein av intresse i detta utdrag genom att skanna densitometri av motsvarande bandet på en SDS-polyakrylamidgel färgat med Coomassie Brilliant Blue R-250 och använder kända koncentrationer av BSA som referens.
2. Fixering av ProIM och ProIMnc på membranet
- Lös två uppsättningar av extrakt som vardera innehåller 1 mikrogram ProIM och ProIM nc på en SDS-polyakrylamidgel enligt standardprotokoll 16.
- Efter elektrofores, placera överföringen gelen i 100 ml överföra buffert (60 mm Glycin, 10 mM Tris, 0,0006% SDS, 20% MeOH) och inkubera under försiktig omrörning i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Electrotransfer de proteiner i gelen en nitrocellulosa membran enligt standardprotokoll 16.
3. Re-vikning av membranbundna proteiner
- Efter electrotransfer, inkubera membranet i 15 min i 15 ml buffert A (30 mM Tris-HCl pH7.4, 0,05% Tween 20) under försiktig omrörning för att avlägsna rester SDS.
- Efter dränering försiktigt, för över membranet till 25 ml denaturering buffert (7 M guanidinhydroklorid, 2 mM EDTA, 50 mm DTT, 50 mM Tris-HCl pH 8,3). och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur under försiktig omrörning. (Obs: nitrocellulosa membran blir ogenomskinligt när de inkuberas i denaturering buffert). och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Överför membranet till 25 ml TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) och inkubera under försiktig omrörning i 5 minuter (Not: Under detta steg återfår membranet sin ursprungliga vita färg).
- Överför membranet till 25 ml av bindande buffert (se steg 1.2) och inkubera vid 4 ° C under försiktig omrörning över natten.
4. Sondera ProIM av Prosol
- Skär membran i två band, båda innehåller ProIM och ProIM NC.
- Gör Prosol och ProSOLnc hybridisering lösningar genom att späda beredningen med 1-10 mikrogram av antingen Prosol eller ProSOLnc i 10 ml rent bindande buffert. Överför varje membran i Prosol eller ProSOLnc hybridisering lösning och inkubera under 1,5 tim vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Ta bort hinnor från hybridisering lösningar och spola tre gånger för 15 min vardera i TBS.
5. Visualisera protein-protein växelverkan med immunoblotting
- Blockera membranet med 2,5% lättmjölk i TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) under 1 timme i rumstemperatur. Späd den primära antikroppen (anti-strepII polyklonala kanin antikropp) i 0,5% lättmjölk i TBST i samma koncentration som rekommenderas av tillverkaren.
- Placera blockerade membran i antikroppen lösning, och inkuberas i 1 timme i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C under försiktig omrörning.
- Skölj membran i 20 ml TBST i 15 min, och två gånger i 5 minuter vid rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Späd sekundär antikropp (anti-kanin IgG-antikropp) konjugerat med pepparrot (HRP) i 0,5% lättmjölk i TBST i samma koncentration som rekommenderas av tillverkaren. Placera membran i sekundär antikropplösning och inkubera i 1 timme i rumstemperatur under försiktig omrörning.
- Skölj membran i 20 ml TBST i 15 min, och två gånger i 5 minuter vid rumstemperatur under försiktig omrörning. Efter den sista sköljningen i TBS, visualisera protein-protein interaktion med hjälp av en HRP-kemiluminiscens substrat (till exempel Millipore Immobilon västra kemiluminiscent HRP-substrat).
- Probe samma membran med den primära antikroppen för taggen smält till ProIM, följt av lämplig sekundär antikropp som beskrivs i steg från 5,1 till 5,4. Visualisera ProIM och ProIMnc beskrivs i steg 5,5 för att verifiera identiteten av banden som erhållits i proteinet membran overlay-analysen (steg 5,5). I de flesta fall är strippning inte nödvändigt, eftersom den signal som erhålls genom att detta steg är mycket starkare än resterande signal som erhålls från steg 5,5.
6. Representativa resultat:
Den ANK-MP interaktion observerades av BiFC i tobak epidermal celler (Figur 1A). Eftersom MP är ett mycket olösligt protein uttryckt i bakterier eller i växter, var det protein membran overlay-analysen antagits för att validera denna interaktion in vitro (Figur 1B). Proteinextrakt innehåller 1 mikrogram av GST-MP (ProIM) eller icke kondenserad GST (ProIM nc) löstes av SDS-polyakrylamidgelelektrofores, följt av electrotransfer till en nitrocellulosa membran. När dessa ProIMs var sonderade med lösligt ANK-strepII (Prosol), GST-MP, men inte icke kondenserad GST, utställda bindande (Figur 1B, körfält 1, 2, jämfört med körfält 5, 6). Dessutom, när samma uppsättning ProIMs har utforskat med icke ProSOLnc, dvs Arabidopsis cytoplasmisk NADH kinas taggade strepII (NADH3-strepII), inga bindande observerades inte, vilket också visar det speciella med ANK-MP interaktion (Figur 1B, körfält 3, 4).
Figur 1. Specifik bindning av tobak ANK till TMV MP in vivo och in vitro. (A) ANK-MP interaktion i levande tobak epidermala celler som upptäckts av BiFC. Stark YFP signal rekonstruerades när MP och ANK, smält till C-terminal och N-terminal halvor YFP, respektive, var coexpressed i tobak epidermis efter microbombardment av deras kodning gener. Detta BiFC signal samlats i puncta på cell-periferi, som är diagnostiska för plasmodesmata 15. (B) ANK-MP interaktionen in vitro som upptäcks av protein-membran overlay-analysen. Proteinextrakt innehåller 1 mikrogram av GST-MP (ProIM) eller icke kondenserad GST (ProIMnc) löstes på en 15% SDS-polyakrylamidgel, följt av electrotransfer på en nitrocellulosa membran. Den GST-MPProIM och GSTProIMnc inkuberades med 0,5 mikrogram / ml ANK-strepII (Prosol), och ANK bindande upptäcktes av sondering membranet med anti-strepII kanin polyklonala antikroppar, följt av anti-kanin IgG + M sekundär antikropp konjugerad med HRP (körfält 1 och 2). Varken GST-MPProIM eller GSTProIMnc interagerade med icke protein, Arabidopsis cytoplasmisk NADH kinas, smält till strepII tagg (ProSOLnc, körfält 3 och 4). Identiteten av bandet som observerats i denna analys bekräftades av sondering membranet med anti-GST antikropp (körfält 5 och 6). När membranet behandlades med denaturering buffert utan att tvättas med buffert A, är bindande för GST-MP till ANK förlorade, medan oidentifierade proteiner som finns i GST-MP och GST contining extrakt protein reagerade med ANK-strepII, vilket visar vikten av de steg 3,1 före denaturering processen (körfält 7 och 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta tillvägagångssätt är lämpligt för testning protein-protein interaktioner mellan kombinationer av proteiner, när minst en av dessa proteiner är lätt löses upp i bindande buffert och framgångsrikt tillämpats på annan kombination av proteiner 17,18. Den iInteractions mellan de proteiner som är både olösliga under dessa förhållanden kan inte testas av detta protokoll.
Dessutom lyckas vika av ProIM kritiska för analysen. Sköljning membranet i TBS efter electrotransfer är nyckeln steget, att resterande SDS kan försämra denaturering / Återställande process.
Slutligen, för att undvika icke-specifik bindning, bör koncentrationen av Prosol i bindningsbuffert inte överstiga 1 mikrogram / ml. Prosol som är alltför koncentrerad kan uppvisa icke-specifik bindning till ProIM. Dessutom kan blockera icke-specifik bindning av membranet immobiliserade proteiner till Prosol, BSA i hybridisering buffert används under steg 4,2 bytas att skumma mjölk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet i vårt laboratorium stöds av anslag från NIH, USDA National Institute of livsmedel och jordbruk, NSF, Bard, DOE, och BSF till VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-PROTEAN system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 | |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 | |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
- Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
- Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
- Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
- Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
- Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
- Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
- Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
- Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).
