Une plate-forme à haut débit automatisé pour le développement de lignées cellulaires de fabrication des protéines thérapeutiques

Summary

Un haut-débit, plate-forme automatisée de développement des cellules de fabrication pour produire des protéines thérapeutiques est décrite. La mise en œuvre de la BD FACS Aria trieur de cellules, CloneSelect Imager et TECAN Freedom EVO système de manipulation de liquides a démontré la capacité de traitement significativement augmenté dans le développement de la lignée cellulaire avec une qualité améliorée de lignée cellulaire et la reproductibilité élevée.

Abstract

L'industrie biopharmaceutique en pleine croissance exige le développement rapide de systèmes de production hautement efficace et fiable pour répondre à l'exigence croissante de l'approvisionnement en médicaments. La génération de lignées cellulaires de production a traditionnellement impliqué des opérations manuelles qui sont main-d'œuvre, à faible débit et les plus vulnérables à des erreurs humaines. Nous rapportons ici une plateforme intégrée à haut débit et automatisé pour le développement de lignées de cellules de fabrication pour la production de protéines thérapeutiques.

La combinaison de la BD FACS Aria ™ trieur de cellules, CloneSelect ™ Imager et TECAN Freedom EVO ® système de manipulation de liquides a permis un processus cellulaire à haut débit et plus efficace ligne de développement. Dans cette opération, les cellules hôtes de production sont d'abord transfectées avec un vecteur d'expression portant le gène d'intérêt ^1, suivi par le traitement avec un agent de sélection. Les cellules transfectées de façon stable sont ensuite colorés avec la fluorescence des anticorps anti-IgG humaines, et sont ensuite soumis à une analyse de cytométrie en flux ^2-4. Cellules très productives sont choisis en fonction de l'intensité de fluorescence et sont isolés par une seule cellule de tri sur une BD ™ FACSAria. La formation de colonies de cellules mono-étape a été détecté au microscope et une série d'images numériques du temps tours sont prises par l'imageur CloneSelect ™ pour la documentation de l'histoire de la lignée cellulaire. Après des clones individuels ont formé, ces clones ont été testés pour la productivité par ELISA effectuée sur un EVO TECAN Freedom ® système de manipulation des liquides. Environ 2,000 - 10,000 clones peuvent être criblés par cycle de fonctionnement avec la configuration actuelle du système.

Cette approche intégrée a été utilisée pour générer de haute production de hamster chinois lignes cellules ovariennes (CHO) pour la production d'anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAb) ainsi que de leurs protéines de fusion. Avec l'aide de différents types de sondes de détection, la méthode peut être utilisée pour développer des protéines thérapeutiques ou être appliqué à d'autres systèmes hôte de production. La comparaison avec la procédure manuelle traditionnelle, cette plate-forme automatisée démontré les avantages d'une capacité nettement accrue, clonalité assurée, de la traçabilité dans l'histoire de la lignée cellulaire avec documentation électronique et la possibilité très réduite dans l'erreur de l'opérateur.

Protocol

1. Transfection de la cellule hôte

1. Graine 2 x 10 ⁶ cellules CHO-DXB11 en flacon T75 Corning culture cellulaire dans 15 ml milieu de croissance (MEMA avec des nucléotides et des nucléosides (Gibco, numéro de catalogue 12571) complété avec 10% γ-irradiés caractérisé sérum fœtal bovin (CFBS) (Hyclone, SH30071.03 numéro de catalogue) et 10 mL / L de solution de glucose à 45% (Sigma, numéro de catalogue G8769)) un jour avant la transfection.
2. Au moment de la transfection, préparer des complexes de transfection comme suit:
   1. Diluer 8 ug d'ADN dans 800 ul de milieu de croissance sans sérum dans un tube à centrifuger stérile. Mélanger délicatement.
   2. Diluer 40 ul Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) dans 800 pl de milieu de croissance sans sérum dans un tube en polystyrène.
   3. Ajouter l'ADN dilué à l'™ Lipofectamine diluée. Mélanger doucement et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
3. Enlever le milieu de croissance des cellules dans T75 et le remplacer par 6,4 ml de milieu de croissance sans sérum. Ajouter le ml 1.6 de complexes de transfection dans le ballon. Mélanger délicatement en faisant basculer la plaque.
4. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ pendant 6 heures.
5. Ajouter 8 ml de milieu de croissance dans le ballon et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ durant la nuit.
6. Retirer milieu par aspiration et ajouter du milieu de croissance frais à la fiole. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ durant la nuit.
7. Remplacez le milieu de croissance à moyen sélection (moyenne MEMA sans nucléotides ou nucléosides (Gibco, numéro de catalogue 12561) complété avec 10% γ-irradiés dialysé de sérum de veau fœtal (DFB) (Hyclone, SH30079.03 numéro de catalogue) et 10 mL / L 45 solution de glucose% (Sigma, G8769 numéro de catalogue)).
8. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ pendant 2-3 semaines.

2. Clonage par cytométrie en flux tri cellulaire activé

1. Déloger les cellules de la fiole et centrifuger à 800 rpm pendant 5 minutes à 4 ° C.
2. Resuspendre les cellules dans le milieu de sélection supplémenté avec 2% d'albumine sérique bovine et marqué par fluorescence anti-IgG humaines à 1:20 de dilution.
3. Incuber dans la glace pendant 15-30 minutes, puis laver deux fois avec du PBS froid. Resuspendre les cellules dans du PBS 1X dans un tube en polypropylène.
4. Préparer pour le tri aseptiques sur une BD ™ FACSAria. Préparer plaque de 96 puits culture cellulaire qui contient 200 ul milieu de sélection dans chaque puits.
5. Aseptiquement charger le tube avec les cellules et d'analyser sur BD FACSAria ™, enregistrer les résultats pour les cellules colorées et non colorées, respectivement.
6. Régler les portes et les paramètres de tri des cellules individuelles du profil désiré dans la coloration fluorescente plaque de 96 puits (s).
   1. Les cellules transfectées sont d'abord analysés sur la base de dispersion avant par rapport à diffusion latérale. Un portail pour les cellules vivantes sont prises en fonction de diffusion vers l'avant, qui mesure la taille d'une cellule, et la diffusion latérale, qui mesure la complexité d'une cellule ou une granularité.
   2. Les cellules qui entrent dans cette porte sont ensuite examinés pour la coloration de PE. PE porte négatif est fixé pour immaculée cellules transfectées ou des cellules hôtes colorées. Comme teinté cellules transfectées sont examinées par FACS, la «High PE" grille est alors délimitée pour englober la partie supérieure de 5% de toutes les cellules qui sont positifs pour la coloration de PE.
7. Incuber les plaques à 37 ° C incubateur pendant deux semaines.

3. Documentation de formation de colonies par CloneSelect ™ Imager

Document de formation de colonies dans les plaques de 96 puits sur les CloneSelect Imager ™ au jour 0, jour 3, jour 7 et 13 jours après la FACS tri. La documentation image sera d'assurer la sélection de clones provenant d'une seule cellule. Une étape cruciale dans cette documentation est de mettre le plan focal correctement réglés pour le jour 0 de mesure, car il n'ya qu'une seule cellule dans chaque puits à ce moment-là. Il est très important que les images de ces cellules simples sont la mise au point et de tenter de régler la netteté sur eux peut être trompeur, au mieux. Le plan focal peuvent varier considérablement entre les marques de plaques et peut-être même d'un lot à la même marque. Ainsi un avion pré-déterminé focal doit être utilisé. Ceci peut être accompli en se concentrant sur le test de micro-billes ou de cellules à haute densité déposés sur des plaques à partir du même lot utilisé. Alternativement, les plaques entièrement développé à partir du même lot peut être utilisé à cette fin. Après le tri par FACS, il est également important de laisser les cellules se contenter d'un minimum de 2 heures avant l'imagerie, afin qu'ils soient «fixés» dans la position sur la plaque.

4. Dépistage et sélection de clones hautement productive

1. Document de position de l'échantillon dans les plaques recevant de 96 puits.
2. Aliquotes de transfert de 20 ul surnageant (diluer si nécessaire) dans des plaques 96 puits d'essai par l'EVO TECAN Freedom ® système de manipulation des liquides. Ce robot flexible et capableIC plateforme a été adaptée pour cela et d'autres travaux automatisé de culture cellulaire. Des programmes spéciaux ont été écrites pour utiliser au mieux et améliorer les capacités Freedom EVO robotique pour le développement de lignées cellulaires. Un exemple de cela est la mise au TECAN pour interpréter les données CloneSelect ™ Imager pour l'échantillonnage des puits avec des colonies isolées. D'autres programmes ont été nécessaires pour effectuer des tâches supplémentaires telles que la culture cellulaire pour faire des dilutions appropriées des échantillons prélevés, d'interpréter, par catalogue et plaques échantillon manuellement marqués, si nécessaire, à l'échelle en haut clones produisant, etc Beaucoup de ces programmes peuvent être facilement appliquée à Plaques 384 puits ainsi que l'original Format 96 puits.
3. La production d'anticorps dans les échantillons sont analysés par un sandwich ELISA détectant les IgG humaines (Pierce, Rockford, IL) sur l'EVO TECAN Freedom ® système de manipulation des liquides.
   1. Les échantillons et standards (Human myélome IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) ont été chargés sur pré-enduits Bio Coat Anti-Human plaques de dosage des IgG (BD Biosciences, San Jose, CA).
   2. Les plaques ont été incubées à température ambiante pendant deux heures, suivi par des lavages PBS trois.
   3. Chèvre ImmunoPure anti-IgG humaine (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) a été ajouté à la plaque à une dilution 1:2000 et incubé pendant une heure à température ambiante.
   4. Les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS avant d'ajouter substrat ABTS (Pierce, Rockford, IL) et ont été lus sur un lecteur de plaque à l'aide d'absorbance à 405 nm pour la détection.
4. Sélectionner des clones très productifs et d'évaluer la productivité en culture en suspension. Pour fed-batch culture, les cellules ont été inoculées à 0.3X106 cellules / ml en protéines moyenne HJR AVANTAGE immédiatement et gratuitement 65 578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) supplémenté avec 5 hydrolysat g / L de soja (DMV International, numéro de catalogue SE50MAF-UF, beaucoup nombre) et incubées à 37 ° C avec 7,5% de CO _2. La culture continue et ont été complétées avec 2 g / L de glucose (Sigma, G8769 numéro au catalogue, 098K2329 numéro de lot) lorsque le glucose, plus la concentration de lactate dans la culture a atteint en dessous de 2 g / L, et nourris de 2 mM de glutamine (Gibco, numéro de catalogue 25030, numéro de lot 568177) lorsque les niveaux de glutamine atteint en dessous de 200 mg / L (métabolites mesurés par YSI Bioanalyzer). Fed-batch cultures ont pris fin le jour 14 et la production d'anticorps a été mesurée par HPLC en phase inverse.
5. La caractérisation génétique des clones candidats par hybridation fluorescente in situ (FISH) ^5.

5. Les résultats représentatifs:

Un exemple de développement d'anticorps produisant des clones avec la méthode à haut débit est montré dans la Figure 1 et Figure 2. Pool de cellules transfectées a été coloré avec marquage fluorescent anti-IgG humaine (figure 1A), analysés et triés sur BD FACSAria ™ (figure 1B). La formation de colonies dans la plaque de 96 puits a été imagé sur CloneSelect Imager ™ (figure 1C). Surnageant de culture cellulaire a été échantillonnée à partir de puits qui contiennent seule colonie et dosés par ELISA sur le système TECAN Freedom EVO ® de manipulation de liquides (figure 1D). Clones très productifs ont été trouvés à partir de cellules exposées plus haut niveau d'anticorps de surface reflétée par coloration avec fluorescence des anticorps anti-IgG humaine. Lorsque l'on compare les clones générés à partir de deux populations de la piscine de cellules transfectées initiale, une grande différence dans la productivité dans la culture fed-batch a été observée (figure 2). Pour les deux premiers clones générés par la population cellulaire avec une expression de surface élevés d'anticorps (PE haute), la productivité spécifique variait de 50 à 70 pg / cellule / jour. Alors que la productivité d'anticorps a été ~ 20 pg / cellule / jour pour les deux premiers clones générés par la population de cellules avec des anticorps de l'expression en surface faible (PE basse). De plus, les lignées cellulaires développé par tri FACS sont plus stables par rapport à la production d'anticorps que ceux qui ont été clonés par dilution chaulage manuel (figure 3A). La productivité spécifique du clone haut, "Clone 1", généré par une dilution manuelle chaulage est passé de ~ 30 à ~ 10 PCD PCD après culture pendant 80 doublements de cellules. D'autre part, le sous-clone supérieure générée par FACS de tri, "Clone 2", a été capable de maintenir la productivité spécifique autour de 20 PCD pour au moins 100 doublements de cellules. Par hybridation in situ fluorescente (FISH), nous avons démontré Clone 1 a montré une population mixte de phénotype A (85%) et le phénotype B (15%). En revanche, FACS triés clone (clone 2) a montré à une population plus homogène, avec 99,5% des cellules s'est avéré être un phénotype. (Figure 3B)

Figure 1. Développement de lignées de cellules de fabrication pour la production d'anticorps monoclonaux à partir de cellules CHO. Coloration de surface A) du pool de cellules transfectées avec initiales marquées par fluorescence anti-IgG humaines. B) Le tri de la population cellulaire avec une intensité de fluorescence élevée (PE haute) et une faible intensité de fluorescence (PE basse) dans la plaque de 96 puits. C) Documenter la coloniela formation du jour 0 au jour 13 post sur l'ensemencement CloneSelect Imager ™. Dépistage des clones D) par ELISA.

Figure 2. Niveau d'anticorps de surface associées est en corrélation avec la productivité d'anticorps de la cellule. Clones avec coloration fluorescente haute et basse ont été développés dans des lignées cellulaires et évaluées dans la culture fed-batch. Volumétrique titre et la productivité spécifiques ont été comparés entre les 2 clones dessus de chaque population.

Figure 3. Clones générés par FACS de tri d'exposition plus élevés homogénéité génétique et de la stabilité clone. A) La production d'anticorps de la stabilité dans la culture batch pour ~ 80 doublements de cellules de temps s'écoulera culture. Δ, clone a été générée par dilution limite, où les cellules ont été ensemencées à 2000 cellules / puits, 1000 cellules / puits et 500 cellules / puits. , Clone a été générée par FACS à 1 cellule / puits. B) site d'intégration de Transgene dans le chromosome de cellules CHO est identifié par hybridation fluorescente in situ.

Discussion

Nous avons présenté une cellule automatisée de fabrication de développement plateforme en ligne qui permet l'isolement de clones très productifs, et en attendant, assure clonalité et la stabilité clone. L'engagement de la coloration des anticorps de surface suivie d'un tri cellulaire FACSAria ™ est la clé pour obtenir des clones individuels de productivité élevés d'anticorps. Nos résultats et d'autres rapports ^2-4 suggèrent que le niveau d'anticorps transitoirement affichés sur la surface des cellules est bien corrélée avec la productivité de la cellule. Ainsi, un anticorps conjugué à la fluorescéine peut être utilisée pour reconnaître les produits associée à la membrane et l'aide de l'isolement des producteurs de haut. Alternativement, la coexpression de gènes rapporteurs et de la technologie micro-goutte de gel ont été utilisés pour faciliter la sélection de forte production de clones par FACS ^6-8. En plus d'isoler haute clones produisant par FACS, d'autres technologies ont évolué pour atteindre le même objectif. Il s'agit notamment de la technologie Trellis CellSpot Bioscience qui utilise des systèmes de détection d'anticorps microspere et la technologie de dépistage au laser pour identifier des clones très productifs et éliminer les cellules indésirables, Genetix ClonePix FL et StemCell Technologies ClonaCell EasyPick plateforme qui effectuent criblage à haut débit de lignées cellulaires de production utilisant un système de détection d'anticorps fluorescents . Nous avons choisi de mettre en œuvre la méthode de clonage FACS basée sur le niveau d'anticorps de surface associées, car il combine la facilité d'utilisation, la sélectivité sur la productivité et la clonalité.

L'emploi de Tecan Freedom EVO ® système de manipulation des liquides considérablement augmenté le débit de dépistage, qui offrent la possibilité de sélectionner des clones à haut rendement à partir d'un pool de cellules beaucoup plus grandes. Autres instruments pour le dosage tels que HTRF, BioForte Octuor, HPLC, etc, sont tous les moyens possibles de sélection des producteurs de haut et de dépistage des producteurs bas. En suivant la formation de clone avec CloneSelect Imager ™, nous avons généré des documents nécessaires pour prouver la clonalité de l'histoire de lignée cellulaire numérisé. Clonalité est encore confirmé par génétiquement caractérisent seul site d'intégration du transgène sur le chromosome. Une étape sous-clonage, qui est habituellement prises pour assurer la clonalité, peuvent ainsi être éliminés. Cela permettra d'économiser 4-8 semaines de temps pour le développement de lignées cellulaires. En résumé, les lignées cellulaires de qualité générés par la plate-forme à haut débit automatisé a montré une productivité élevée, la stabilité de production et de l'histoire documentée lignée cellulaire qui devrait répondre à la demande à grande échelle de production et les exigences réglementaires actuelles.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACS Aria™ Cell Sorter	BD Biosciences
CloneSelect™ Imager	Genetix
TECAN Freedom EVO® liquid handling system	Tecan Group Ltd.