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Biology

脑片的刺激,利用微流控网络和标准灌注腔

doi: 10.3791/302 Published: October 1, 2007

Summary

我们证明一个简单的微流体装置,可与标准的电设置综合揭露一个很好的控制方式不同的神经递质的大脑切片的微观表面加工。

Abstract

我们已经证明了两个级别的微流体装置,可以很容易地与现有的电设置集成制造。两个级别的微流体装置是采用两个步骤的标准,消极抵制光刻工艺1。第一层次包含在每年年底与入口和出口微。第二个层次包含位于通道长度的中间,与通道宽度为中心沿微型圆孔。被动抽水的方法是用泵的液体,从进气口, 出气口2。集成微流体装置与现成的灌注商会,允许无缝集成与电设置。在进气道流通过对出口口岸的微流体介绍,并通​​过位于顶部的微灌注洗澡的圆形开口也难逃。因此可以接触不同的神经递质的大脑切片置于灌注室浴及以上的微流体装置的底部表面。微流体装置的微型厚度和材料的透明性玻璃盖玻片和PDMS(聚二甲基硅氧烷)]用于制造微流体装置允许的大脑切片的显微镜。微流体装置,可以介绍到大脑切片的微环境的化学刺激(包括空间和时间)调制。

Protocol

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SU - 8模具制造

硕士准备

  1. 硅片衬底上的SU - 8的主人是准备使用两个步骤的标准消极抵制光刻工艺。
  2. 被删除的硅片上的对准标记(位于外周边沿晶圆),使用这些结构的高度刀片超过实际设备结构。
  3. 硅片,然后用异丙醇清洗和干燥后 N 2流。与胶带厚度小于最高的器件结构的支柱取代四边晶圆对准标记。

    注:
    如果支柱的高度超过最高的器件结构,通孔中形成的PDMS模具。

  4. 主硅片上放置一个在室温下的热板。

PDMS的解决方案的准备

  1. 四克的聚二甲基硅氧烷(PDMS)的解决方案是准备彻底搅拌1固化剂的一部分10有机硅弹性体的部分。

    注意 :请确保这两个解决方案是混合均匀,整个PDMS模具获得类似的物理性质,化学性质。

  2. 使用真空干燥器,在PDMS的解决方案,在搅拌过程中产生的气泡被删除。

硅橡胶涂料和固化

  1. 无气泡的PDMS的解决方案是慢慢配发到SU - 8的掌握,确保在配药过程中不产生气泡。
  2. 的热点板块,然后放置在一个透明胶片上写的一端,慢慢地放在对PDMS解决方案的PDMS均匀分布到SU - 8的主。在此过程中所产生的任何气泡需要使用一个探头被删除。

    [注:不要抬起的透明度,以防止产生更多的气泡。

  3. 一个BOROFLOAT板被放置在顶部的透明度负债表,适用于均匀的压力。温柔的压力是最高的圆形结构的顶面(位于中间的通道长度和沿渠道的宽度为中心)等,很少或没有的PDMS夹着之间的透明度和SU - 8的圆形表面上应用结构。
  4. 三个BOROFLOAT砖放置在硅片BOROFLOAT板夹心适用于顶面的圆形开口结构前,在固化过程中恒压之上。
  5. 热板的温度,然后增加至75 ° C,在此温度下固化的PDMS为1小时。热板温度50 ° C
  6. 地砖被删除,轻轻除去留下的掌握和在它的上面涂薄的PDMS表的透明度。

微流体装置的建设

PDMS的表删除从主

  1. 使用刀片对准SU - 8的主端口上灌注室的端口后的PDMS表上雕刻出灌注室的外部边界。
  2. 的PDMS表删除,然后轻轻地从主,​​拉动沿长度的渠道,以防止硅橡胶撕裂。的PDMS负债表上放置一个微流体网络的表面朝上的透明度表。
  3. 入口和出口,然后使用软木螟。

PDMS的表粘接玻璃盖玻片

  1. 的PDMS表(含表面微流体网络)和玻璃盖玻片的粘接面,然后轻轻清洗使用3M透明胶带,放在一张透明度,并终于在O 2等离子室。
  2. 粘接表面处理血浆165瓦,10秒等离子体处理表面的玻璃盖玻片立即保税的等离子体处理后的PDMS片表面。

    注:适用于玻璃表面上的温和压力,以消除任何粘接表面之间的空气被困气泡。

  3. 允许5分钟获得PDMS和玻璃之间的良好的粘接。 5分钟后,轻轻取出的PDMS表是用于粘接过程中的透明度。
  4. 微流体装置被放置在氧等离子体系统,使渠道亲水。等离子体处理1分钟,在165瓦。

集成微流体装置和灌注室

灌注腔的制备

  1. 一个现成的,现成的灌注室的命令,入口和出口,使钻保税微流体装置和室时,上腔和设备的端口是一致的。灌注腔的底部表面涂以PDMS的获得之间的商会和微流体装置的密封。
  2. 透明度负债表上写上热板在室温下放置。
  3. 一克的PDMS解决方案是准备在前面所描述的过程类似。无气泡的PDMS的解决方案,然后慢慢地配发到的透明度负债表,避免产生气泡。
  4. 灌注室,然后放置在PDMS的解决方案。
  5. 一个BOROFLOAT板,然后放置在腔的顶部,适用于均匀的压力,并获得室底部表面上的PDMS涂层薄。
  6. 热板的温度,然后增加至75 ° C,在此温度下固化的PDMS为1小时。

粘接微流体装置和灌注室

  1. 板坯将被删除,轻轻离开背后的灌注室,并在其底部表面薄的PDMS表涂删除的透明度。使用一个刀片和一个尖锐的探针从接入端口的PDMS去除无用的PDMS被删除。
  2. 硅橡胶表面的微流体装置和室的PDMS的底部表面,然后轻轻地清洗使用3M胶带,放在一张透明度,并最终在氧离子室放置。
  3. 165瓦10秒的等离子体表面处理立即保税室的PDMS涂层表面的PDMS表面的微流体装置。

    注:适用于玻璃表面上的温和压力,以消除任何粘接表面之间的空气被困气泡。

  4. 紧随在使用前,该设备是放置在氧等离子体系统,使渠道亲水。等离子体处理1分钟,在165瓦。

使用微流体装置,使脑切片神经化学物质的微环境

  1. 亲水性微(微流体装置) - (灌注室)的组合充满标准学联(人工脑脊髓液)解决方案。
  2. 免除在进气道学联解决方案的小滴,让溶液成渠道恶人。删除使用注射器从出气口左侧的任何气泡。免除在出气口大降了学联的解决方案,让被动的流体泵送从入口到微流体装置的电源插座端口。

    注:应采取删除所有通道气泡,允许使用被动抽水方法流体流动。

  3. 修复(微流体装置) - (灌注室)在平原平台组合和修复显微镜适配器平原平台。
  4. 连接标准的入口和出口(吸)管灌注室连续灌注的脑片与标准学联解决方案。学联的解决方案是连续吸入95%O2 - 5%的CO 2。

    注:调整吸痰管灌注室洗澡,保持学联稳定的水平。

  5. 一旦灌注室充满学联解决方案,在灌注室使用滴管的大脑切片。使用探针,上述脑片在微流体装置的圆形开口的位置。一旦脑片圆形开口的位置,使用切片锚固定的大脑切片。
  6. 微流体装置,现在可以用来揭露的大脑切片放置在灌注室和微流体网络上使用被动泵送流体的各种神经递质。

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Discussion

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现有的宏观或微观的脑片灌注商会在他们提供公开与神经递质的大脑切片的空间分辨率是有限的。这里展示的微流体装置的技术克服了这个限制,使用简单的微机电技术。据预计,在微流体设备制造和易于集成与现有的电设置简单,使所显示的设备技术的广泛应用。有趣的实验是不可能的前面,可以与目前的微流体装置。脑片不同的微环境,可以接触到不同的神经递质,在不同的时间尺度。目前的原型设备包括只有四个平行的渠道和相互旁边的圆形开口。然而,此设备布局可以很容易地改变通过实施不同的设计,将有不同的形状或大小,或微开口,可在一个时尚,这将导致在不同的微环境的大脑切片的开口的定位蜿蜒。

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Disclosures

作者涉及生物学的不同领域表现出的微流体技术的合作是开放的。

Acknowledgments

经费是由美国国立卫生研究院MH - 64611和NARSAD青年研究者奖。作者还想Beagley,马克Dikopf,亚当史密斯和Ben承认他们的技术援助。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
RC-26GPL Tool Warner Instruments W2-64-0236 Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber
SHD-26GH/10 Tool Warner Instruments W2-64-0253 Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing
PDMS (polydimethylsiloxane) Reagent Dow Corning Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit
Plasma Preen-II 862 Tool Plasmatic Systems, Inc. Microwave plasma system
Model P-1 Tool Warner Instruments W2-64-0277 Series 20 Plain Platform, Model P-1
SA-NIK Tool Warner Instruments W2-64-0291 Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK
Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) Reagent Exact composition will vary with application

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References

  1. Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
  2. Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
脑片的刺激,利用微流控网络和标准灌注腔
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Shaikh Mohammed, J., Caicedo, H., Fall, C. P., Eddington, D. T. Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber. J. Vis. Exp. (8), e302, doi:10.3791/302 (2007).More

Shaikh Mohammed, J., Caicedo, H., Fall, C. P., Eddington, D. T. Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber. J. Vis. Exp. (8), e302, doi:10.3791/302 (2007).

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