Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Подготовка E18 корковых нейронов крысы за раздробленности в микрожидкостных устройств

doi: 10.3791/305 Published: October 1, 2007

Summary

В этом видео мы демонстрируем подготовки E18 корковых нейронов крысы.

Abstract

В этом видео, мы демонстрируем подготовки E18 корковых нейронов крысы. E18 корковых нейронов крысы получают из коры плода E18 крысы ранее расчлененных и подготовлены. Коры E18 есть на рассечение, сразу же распадается на отдельные нейроны. Можно хранить E18 коры в Hibernate E буфер, содержащий B27 при 4 ° С не более недели, прежде чем диссоциация не выполняется. Тем не менее, будет падение жизнеспособности клеток. Обычно мы получим нашу E18 Cortex свежим. Они транспортируются в лабораторию в ледяной Кальций Магний свободный свободный буфер рассечение (CMFM). Прибыв на место, трипсина добавляется в коре до конечной концентрации 0,125%. Коры затем инкубировали при 37 ° С в течение 8 минут. DMEM, содержащей 10% FBS добавляется в коре, чтобы остановить реакцию. Коры затем центрифугировали при 2500 оборотах в минуту в течение 2 минут. Супернатант удаляют и 2 мл нейронных Базальные Media (НБМ), содержащий 2% B27 (об / об) и 0,25% Glutamax (об / об) добавляется к коре, которая затем повторно приостановлено пипетирования вверх и вниз. Далее, коры растирают с ранее огнем полированные стеклянные пипетки, каждый из которых последовательно меньшие отверстия. После растирания, коры вновь центрифугировали при 2500 оборотах в минуту в течение 2 минут. Супернатант затем удаляется и коры гранулы ресуспендировали с 2 мл НБМ содержащие B27 и Glutamax. Клеточной суспензии затем проходит через сетчатый фильтр 40 мкм ячейка нейлона. Следующая ячейки учитываются. Нейронов теперь готовы для загрузки в устройство нейрона микрожидкостных.

Protocol

Подготовка E18 плода крысы корковых нейронов для фрагментации

Прежде чем начать, важно, чтобы согреть все необходимые средства массовой информации и реагенты до 37 ° C.

Важно также, чтобы стерилизовать все, что используется для приготовления клеток (например, резиновые луковицы, трубки стеллажи, средств массовой информации бутылки и т.д.), и то, что помещается в капот, путем протирания вниз с 70% этанола.

  1. Положите два куска E18 плода Cortex Крыса (один мозг, ранее расчлененных) в 15 мл пробирку, содержащую 1 мл ледяной кальция без магния без буфера рассечение.
  2. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-EDTA в кору головного мозга в рассечение буфера, в результате чего конечный объем до 2 мл и конечной концентрации трипсина до 0,125%.
  3. Место 15 мл трубки в 37 ° С водяной бане в течение 8 минут.
  4. За это время огонь польский 3 стакана Пастера пипец, образуя последовательно меньшие отверстия, в кабинете биологической безопасности, чтобы помочь сохранить стерильность.
  5. После 8 минут инкубации коры, добавьте 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS в кору головного мозга, чтобы помочь остановить трипсина реакции.
  6. Центрифуга 15 мл пробирку коры и DMEM/10% ЭТС при 2500 оборотов в минуту в течение 2 минут.
  7. В кабинете биобезопасности, удалить супернатант из коры использованием пипетки Пастера стекла с вакуумной всасывания прилагается. Будьте осторожны, чтобы не нарушить или выбить гранул.
  8. Добавить 1 мл NMB в кору головного мозга гранул и осторожно пипеткой вверх и вниз. Это очень важно, чтобы избежать создания пузырьков воздуха в то время как pipeting вверх и вниз, как пузырьки воздуха могут повредить клетки в результате окисления.
  9. Используйте огневой полировкой пипетки Пастера с самой широкой открытости измельченного в порошок коры путем присоединения стерильные резиновые лампы до конца и pipeting вверх и вниз 5 раз, опять же будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха. Продолжайте этот процесс с другими 2 пипец стекла, каждый из которых снизилась открытия размера.
  10. После растирания, центрифуги вниз клетки снова при 2500 оборотов в минуту в течение 2 минут.
  11. После центрифугирования, еще раз удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл НБМ.
  12. Фильтры ресуспендировали решение клетки через 45 мкм фильтр клетки.
  13. Пятно клеток с Трипановый Синий, посчитали, и загружаются в устройства. Как правило, мы нагрузка 20 мкл клеток на устройстве.

Примечание: Конечная концентрация клеток, как правило, от 2,5 млн. кл / мл и 8 миллионов клеток / мл

Загрузка клетки

После клетки были пересчитаны, пришло время для загрузки клеток в устройстве:

  1. Принесите заранее подготовленные устройств, содержащих НБМ в кабинет биобезопасности для поддержания стерильности.
  2. Удалите излишки средств массовой информации из скважин путем вакуумного всасывания. Однако, будьте осторожны, чтобы избежать удаления всех средств массовой информации - должны быть некоторые средства массовой информации в основном канале.
  3. Применяют 20 мкл клеток в левый верхний резервуар руку устройства (см. схему при необходимости). Клетки впадают в устройство и подключить к PLL обрабатываемой поверхности.
  4. После загрузки, места устройства, содержащие клетки обратно в инкубаторе в течение 10 минут, чтобы дать клеткам прикрепить.
  5. Через 10 минут заполнить резервуары со средствами массовой информации и разместить устройств еще в инкубаторе.

Discussion

Сотовые плотность может меняться в зависимости от приложения. Однако, посев первичных нейронов при слишком низкой плотности обычно приводит к гибели клеток. В зависимости от инкубатора и уровень влажности, средства массовой информации, возможно, должны быть изменены в устройства каждые 2 до 3 дней. При смене медиа, важно после удаления информации из водохранилищ, чтобы никогда не извлекайте носитель из основных каналов. Кроме того, она является хорошей практикой является размещение свежей информации в верхней скважин и позволяет свежим СМИ течь через устройство и на основных каналах до заполнения всех водоемах.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NBM medium Invitrogen 21103-049 Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos Animal Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS buffer ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA Reagent Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets Fisher Scientific glass
DMEM medium Invitrogen
FBS Reagent Invitrogen serum, used at 10% in DMEM
centrifuge set at 2500 rpm
Trypan Blue Invitrogen for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um Tool BD Biosciences Falcon cat# 352340 Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
Подготовка E18 корковых нейронов крысы за раздробленности в микрожидкостных устройств
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).More

Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter