Summary
В этом видео мы демонстрируем подготовки E18 корковых нейронов крысы.
Abstract
В этом видео, мы демонстрируем подготовки E18 корковых нейронов крысы. E18 корковых нейронов крысы получают из коры плода E18 крысы ранее расчлененных и подготовлены. Коры E18 есть на рассечение, сразу же распадается на отдельные нейроны. Можно хранить E18 коры в Hibernate E буфер, содержащий B27 при 4 ° С не более недели, прежде чем диссоциация не выполняется. Тем не менее, будет падение жизнеспособности клеток. Обычно мы получим нашу E18 Cortex свежим. Они транспортируются в лабораторию в ледяной Кальций Магний свободный свободный буфер рассечение (CMFM). Прибыв на место, трипсина добавляется в коре до конечной концентрации 0,125%. Коры затем инкубировали при 37 ° С в течение 8 минут. DMEM, содержащей 10% FBS добавляется в коре, чтобы остановить реакцию. Коры затем центрифугировали при 2500 оборотах в минуту в течение 2 минут. Супернатант удаляют и 2 мл нейронных Базальные Media (НБМ), содержащий 2% B27 (об / об) и 0,25% Glutamax (об / об) добавляется к коре, которая затем повторно приостановлено пипетирования вверх и вниз. Далее, коры растирают с ранее огнем полированные стеклянные пипетки, каждый из которых последовательно меньшие отверстия. После растирания, коры вновь центрифугировали при 2500 оборотах в минуту в течение 2 минут. Супернатант затем удаляется и коры гранулы ресуспендировали с 2 мл НБМ содержащие B27 и Glutamax. Клеточной суспензии затем проходит через сетчатый фильтр 40 мкм ячейка нейлона. Следующая ячейки учитываются. Нейронов теперь готовы для загрузки в устройство нейрона микрожидкостных.
Protocol
Подготовка E18 плода крысы корковых нейронов для фрагментации
Прежде чем начать, важно, чтобы согреть все необходимые средства массовой информации и реагенты до 37 ° C.
Важно также, чтобы стерилизовать все, что используется для приготовления клеток (например, резиновые луковицы, трубки стеллажи, средств массовой информации бутылки и т.д.), и то, что помещается в капот, путем протирания вниз с 70% этанола.
- Положите два куска E18 плода Cortex Крыса (один мозг, ранее расчлененных) в 15 мл пробирку, содержащую 1 мл ледяной кальция без магния без буфера рассечение.
- Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-EDTA в кору головного мозга в рассечение буфера, в результате чего конечный объем до 2 мл и конечной концентрации трипсина до 0,125%.
- Место 15 мл трубки в 37 ° С водяной бане в течение 8 минут.
- За это время огонь польский 3 стакана Пастера пипец, образуя последовательно меньшие отверстия, в кабинете биологической безопасности, чтобы помочь сохранить стерильность.
- После 8 минут инкубации коры, добавьте 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS в кору головного мозга, чтобы помочь остановить трипсина реакции.
- Центрифуга 15 мл пробирку коры и DMEM/10% ЭТС при 2500 оборотов в минуту в течение 2 минут.
- В кабинете биобезопасности, удалить супернатант из коры использованием пипетки Пастера стекла с вакуумной всасывания прилагается. Будьте осторожны, чтобы не нарушить или выбить гранул.
- Добавить 1 мл NMB в кору головного мозга гранул и осторожно пипеткой вверх и вниз. Это очень важно, чтобы избежать создания пузырьков воздуха в то время как pipeting вверх и вниз, как пузырьки воздуха могут повредить клетки в результате окисления.
- Используйте огневой полировкой пипетки Пастера с самой широкой открытости измельченного в порошок коры путем присоединения стерильные резиновые лампы до конца и pipeting вверх и вниз 5 раз, опять же будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха. Продолжайте этот процесс с другими 2 пипец стекла, каждый из которых снизилась открытия размера.
- После растирания, центрифуги вниз клетки снова при 2500 оборотов в минуту в течение 2 минут.
- После центрифугирования, еще раз удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл НБМ.
- Фильтры ресуспендировали решение клетки через 45 мкм фильтр клетки.
- Пятно клеток с Трипановый Синий, посчитали, и загружаются в устройства. Как правило, мы нагрузка 20 мкл клеток на устройстве.
Примечание: Конечная концентрация клеток, как правило, от 2,5 млн. кл / мл и 8 миллионов клеток / мл
Загрузка клетки
После клетки были пересчитаны, пришло время для загрузки клеток в устройстве:
- Принесите заранее подготовленные устройств, содержащих НБМ в кабинет биобезопасности для поддержания стерильности.
- Удалите излишки средств массовой информации из скважин путем вакуумного всасывания. Однако, будьте осторожны, чтобы избежать удаления всех средств массовой информации - должны быть некоторые средства массовой информации в основном канале.
- Применяют 20 мкл клеток в левый верхний резервуар руку устройства (см. схему при необходимости). Клетки впадают в устройство и подключить к PLL обрабатываемой поверхности.
- После загрузки, места устройства, содержащие клетки обратно в инкубаторе в течение 10 минут, чтобы дать клеткам прикрепить.
- Через 10 минут заполнить резервуары со средствами массовой информации и разместить устройств еще в инкубаторе.
Discussion
Сотовые плотность может меняться в зависимости от приложения. Однако, посев первичных нейронов при слишком низкой плотности обычно приводит к гибели клеток. В зависимости от инкубатора и уровень влажности, средства массовой информации, возможно, должны быть изменены в устройства каждые 2 до 3 дней. При смене медиа, важно после удаления информации из водохранилищ, чтобы никогда не извлекайте носитель из основных каналов. Кроме того, она является хорошей практикой является размещение свежей информации в верхней скважин и позволяет свежим СМИ течь через устройство и на основных каналах до заполнения всех водоемах.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
