Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Summary

We hebben een basis van collageen

Abstract

Borstkanker is een belangrijke oorzaak van sterfte in de Westerse wereld. Het staat vast dat de verspreiding van borstkanker eerst lokaal en later distaal, is een belangrijke factor in de patiënt prognose. Experimentele systemen van borstkanker vertrouwen op cellijnen meestal afgeleid van de primaire tumoren of pleurale effusie. Twee belangrijke obstakels verhinderen dit onderzoek: (i) een aantal bekende sub-types van borstkanker (met name een slechte prognose luminale B tumoren) zijn niet vertegenwoordigd binnen de huidige regel collecties, (ii) de invloed van de tumor micro-omgeving is doorgaans niet in aanmerking genomen.

We tonen een techniek om cultuur primaire borstkanker exemplaren van alle sub-types. Dit wordt bereikt door gebruik te maken driedimensionale (3D) cultuur systeem waarin kleine stukjes van de tumor zijn ingebed in zachte rat collageen I kussens. Binnen 2-3 weken, de tumorcellen zich in de collageen en vorm verschillende structuren vergelijkbaar met die waargenomen in de menselijke tumours1. Levensvatbare adipocyten, epitheelcellen en fibroblasten in de oorspronkelijke kern waren duidelijk op histologie. Kwaadaardige epitheliale cellen met squamoid morfologie werden gedemonstreerd binnendringen in het omliggende collageen. Nucleaire pleomorfisme was duidelijk in deze cellen, samen met mitotische figuren en apoptotische lichamen.

We hebben in dienst optische projectie Tomografie (OPT), een 3D-imaging technologie, om de omvang van de tumor zich in de cultuur te kwantificeren. We hebben OPT gebruikt om het grootste deel volume van de tumor cultuur te meten, een parameter routinematig gemeten tijdens de neo-adjuvante behandeling van patiënten met borstkanker om de respons op behandeling met geneesmiddelen te beoordelen.

Hier presenteren we een kans om cultuur borsttumoren bij de mens zonder sub-type bias en kwantificeren van de verspreiding van die ex vivo. Deze methode kan worden gebruikt in de toekomst van drugs gevoeligheid in de oorspronkelijke tumor te kwantificeren. Dit kan zorgen voor een meer voorspellend model dan de momenteel gebruikte cellijnen.

Protocol

1. Extraheren van collageen uit Rat Tails

1. Leg bevroren verse rat staarten in 70% ethanol.
2. Deglove de overliggende huid met een scalpel bloot pezen.
3. Strip pezen uit de buurt van de staart en plaats in 70% ethanol om te steriliseren.
4. Weeg de verzamelde pezen en transfer naar azijnzuur (1g pees tot 250ml 0,5 M azijnzuur). Mix voor 48hr bij 4 ° C.
5. Centrifugeer de pees / azijnzuur mix bij 10.000 g voor 30 minuten en gooi de pellet.
6. Voeg een gelijk volume van 10% (w / v) NaCl aan het supernatant en laat het mengsel een nacht staan ​​bij 4 ° C.
7. Verzamel de collageen-rijke, onoplosbaar onderste laag en centrifugaat voor een verdere 30 minuten bij 10.000 g
8. Resuspendeer de collageen-rijke materiaal in 0,25 M azijnzuur bij 4 ° C en dialyse tegen 1:1000 azijnzuur bij 4 ° C gedurende 3 dagen, het veranderen van de dialyse-buffer tweemaal daags.
9. Verder steriliseren van de collageen-oplossing door middel van centrifugatie (20.000 g voor 2 uur) en bewaar bij 4 ° C.
10. Verdunnen collageen indien nodig met de toevoeging van steriele 1:1000 azijnzuur een voorraad concentratie van 1mg/ml.

2. 3D-Assay Creation

De 3D-test is gebaseerd op een cellijn-test, gepubliceerd voorheen ^2.

1. Multiple core biopsies worden geoogst vanaf stemt patiënten ten tijde van de curatieve chirurgische resectie voor invasieve borstkanker.
2. Met het blote oog, verdeel de kernen met behulp van een scalpel in 1mm ³ fragmenten. Trim en gooi macroscopisch duidelijk vet.
3. Dompel de fragmenten in MEGM Compleet media. Het weefsel kan worden opgeslagen in deze staat voor maximaal 1 uur.
4. Voor het maken van het collageen gel, mix op ijs 1mg/ml rattenstaart collageen, tot 1:1000 gefilterd azijnzuur, 10x DMEM/F12 en 0.22M NaOH in een verhouding van 3:5:1:1 creëren een uiteindelijke collageen concentratie van 0,3 mg / ml.
5. Injecteer 1,2 ml van collageen mengsel in afzonderlijke putjes van een 24 wells plaat en breng het in een incubator bij 37 ° C gedurende 10min te geleren te starten.
6. Na 10min, verwijder de 24 wells plaat uit de incubator. Leg de stukjes tumor op de gelering collageen en duw ze in het centrum van de gel met behulp van een pipet 10μl tip. De terugkeer van de 24 wells plaat naar de incubator voor 1 uur.
7. Voor ER + tumoren, aan te vullen MEGM Compleet media met β-oestradiol tot een concentratie van 3.2x10 ^-10 M. Zodra de gel assays hebben gegeleerde voor 1 uur, voorzichtig 1,2 ml van het aangevulde media introduceren in elk putje. De uiteindelijke β-oestradiol concentratie in de test zal equilibriate om 1.6x10 ^{-10 m} aan fysiologische oestrogeenspiegels gevonden in borstweefsel ³ herhalen.
8. Voer een 10μl pipettip rond de binnenrand van elk goed, het vrijgeven van elke gel de omtrek, zodat elke gel vrij zweven in de media. De terugkeer van de 24 wells plaat naar de incubator.
9. Exchange aangevuld media tweemaal per week tot het einde van het experiment. Beëindig het experiment door het verwijderen van de media en het toevoegen van een formaline fixeermiddel.

3. Antilichaam kleuring of Assay ter voorbereiding van optische projectie Tomography

We hebben een eerder gepubliceerde methode voor het hele steekproef vlekken ^4.

1. Was formaline gefixeerde monsters voor 30 minuten in PBS. Uitdrogen van de gels stapsgewijs in methanol verdund in PBS dat 0,05% Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% en 100% voor ≥ 15 minuten bij elke stap.
2. Incubeer het weefsel in de vers bereide MeOH: DMSO: 30% H ₂ O ₂ in een verhouding van 02:01:03 (15% v / v H ₂ O ₂₎ bij kamertemperatuur gedurende 24 uur aan de autofluorescentie te lessen.
3. Twee keer wassen monsters voor 30min in methanol. Freeze de monsters tot -80 ° C vijf keer voor minstens 1 uur per keer en weer op kamertemperatuur (RT) die antigenen zorgen in de diepere delen van het weefsel zijn toegankelijk gemaakt.
4. Hydrateren het weefsel terug tot 0,05% PBST met methanol als oplosmiddel (33%, 66% en 100% voor 15 minuten bij elke stap).
5. Blokkeer het weefsel in het blokkeren van oplossing (10% serum in 0,05% PBST) voor 24 uur.
6. Incubeer het weefsel met een primaire antilichaam voor de epitheliale inhoud te identificeren, met behulp van konijnen anti-cytokeratine bij een concentratie van 1:500 verdund in 1,5 ml van het blokkeren van oplossing met 5% DMSO voor 48hr.
7. Was monsters vier keer met 0,05% PBST voor 30min per stuk.
8. Incubeer het weefsel met fluorescerende secundair antilichaam (1:100 geit anti-konijn Alexa555), verdund in 1,5 ml blokkeren oplossing met 5% DMSO voor 48hr.
9. Was weer de monsters met 0,05% PBST vier keer voor 30 minuten elk.

4. Optische projectie Tomografie

Optische projectie tomografie is een techniek die eerder ontwikkelde microscopie om hoge resolutie 3D-beelden van TL-biologische monsters te produceren met een dikte tot 15 mm ^5.

1. Monteer de sgehandhaafd gel in 1% laag smeltpunt agarose en uitdrogen in 100% methanol voor 24 uur. Schakel het model in Babb-oplossing (1:2 benzylalcohol, benzylbenzoaat) voor 48hr en scannen met behulp van het OPT 3001M Scanner (Bioptonics).
2. Zowel de doelgroep en autofluorescentie worden gevangen met behulp van de Cy3 filter set (exciter 545nm/30 nm, emitter 610/75 nm) en GFP1 filter set (exciter 425nm/40 nm, emitter LP475 nm) respectievelijk.

5. Reconstructie-en 3D-kwantificering

1. De set van hoekige projecties overgenomen door OPT kan worden gereconstrueerd met behulp van NRecon software (SkyScan) om een ​​reeks van doorsnede plakjes door de invasie-test maken. Deze software is beschikbaar voor gratis downloaden op http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
2. Analyseer de gereconstrueerde gegevens met behulp van Volocity software (PerkinElmer). Gratis demonstratie software is beschikbaar voor downloaden op http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
3. Met het oog op epitheliale volume cytokeratine kleuren te kwantificeren, een minimum voxel intensiteit drempel om storing te verminderen van achtergrond fluorescentie in het doel kanaal. Definieerden we empirisch deze drempel bij 9000 au Met behulp van een lijst met beschikbare parameters in de applicatiesoftware voor meten, we gekwantificeerd het volume van de epitheel in continuïteit met de oorspronkelijke kern (afgebakend in de autofluorescente kanaal). Dit liet ons toe om volumes van epitheliale uitgroei kwantificeren tussen de verschillende tumor monsters.

6. Representatieve resultaten:

Tijdens de ontwikkeling van de test, een totaal van 52 borstkanker biopsie exemplaren met een brede waaier van histopathologische zijn gebruikt. Van deze <10% (5 / 52) niet ten minste een levensvatbare invasie assay te bieden. Test te wijten was aan een bacteriële supra-infectie of onvoldoende tumor biopsie materiaal. Daarom is de toepassing van de test is niet beperkt tot een bepaald subtype van borstkanker.

Typische assays (figuur 1) vast na 20 dagen in collageen cultuur en vervolgens gekleurd voor cytokeratine. Volocity software is in staat om zowel de epitheliale bulk continu met de oorspronkelijke kern en vrijstaande groepen van binnendringende cellen herkennen en afzonderlijk te kwantificeren elk volume.

Figuur 1. Invasion testen na fixatie en kwantificering. De test ondersteunt monsters verkregen van meerdere subtypen borstkanker: a) ER + b) HER2 + en c) ER-.

Discussion

Op basis van collageen assays om het gedrag van kanker cellijnen studie zijn nu op grote schaal gebruikt ^6,7,8. Toch hebben deze testen niet terug te vinden in volle de complexiteit van de tumor en zijn omgeving. In deze studie hebben we laten zien dat de menselijke borstkanker materialen kunnen worden gebruikt op een vergelijkbare manier, ex vivo. Verder OPT is een nuttig hulpmiddel om de 3D-uitbreiding van borstkanker te karakteriseren. We vonden dat de belangrijkste beperking van deze techniek is de beschikbaarheid van de tumor materialen (een single core biopsie is voldoende voor 4-6 assays). Een andere beperkende factor is dat structurele invasie komt alleen voor bij ongeveer 40% van de testen. Om dit, wij regelmatig toe te voegen elke gewenste behandeling rond dag 7 tot alle testen met zichtbare groei.

Het gebruik van OPT zou kunnen worden uitgebreid in de toekomst ook te detecteren bulk veranderingen, ex vivo, als gevolg van behandeling met geneesmiddelen. Dit op zijn beurt zou kunnen vergemakkelijken, meer geïndividualiseerde behandeling van kanker, onafhankelijk van diermodellen. We zijn momenteel het verkennen van de reactie van ER + tumoren aan tamoxifen ex vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEGM Complete	Lonza Inc.	CC-3150
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8900 10X1L
β-–stradiol	Sigma-Aldrich	E8875-250MG
Rabbit anti-cytokeratin	Dako	Z0622
Goat anti-rabbit Alexa555	Invitrogen	A21422
All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich.