Summary
우리는 콜라겐 기반을 개발
Abstract
유방암은 서양 세계에서 사망의 주요 원인이다. 이곳은 유방암의 확산은 먼저 로컬 나중에 distally, 환자 예후에 중요한 요인임을 설정됩니다. 유방암의 실험적 시스템은 일반적으로 기본 종양이나 흉막 effusions에서 파생된 세포 선에 의존하고 있습니다. 두 가지 주요 장애물이 연구를 저해 : (I) 유방 암 (특히 가난한 예후 luminal B 종양)의 하위 유형의 알려진 일부 현재 라인 컬렉션 내에 표시되지 않습니다; (2) 종양의 microenvironment의 영향은 일반적으로 고려되지 않습니다.
우리 모두는 하위 유형의 문화 일차 유방암 표본에 대한 기술을 보여줍니다. 이것은 종양의 작은 조각이 나는 부드러운 쿠션 쥐의 콜라겐에 포함된하는 입체 (3D) 문화 시스템을 사용하여 이루어진다. 2-3 주 내에, 종양 세포는 콜라겐으로 확산하고 인간 tumours1에서 관찰 비슷한 여러 구조를 형성하고 있습니다. 가능한 adipocytes는 원래 핵 내에 상피 세포와 섬유아 세포가 조직학에 분명했다. squamoid 형태와 악성 상피 세포는 주변의 콜라겐에 폐를 끼치고 시연했다. 핵 pleomorphism은 mitotic 인물과 apoptotic 기관과 함께,이 세포 내에서 분명했다.
우리는 문화의 종양 확산의 범위를 정할 수 있도록 광학 프로젝션 Tomography (OPT), 3D 이미징 기술을 고용했습니다. 우리는 종양 문화의 대량 볼륨을 측정하는 OPT를 사용하여 있고, 매개 변수는 정기적으로 약물 치료에 반응을 평가하는 유방암 환자의 네오 도움이되는 치료를하는 동안 측정.
여기, 우리는 하위 유형 편견없이 문화를 인간의 유방 종양 수있는 기회를 제시하고 그 전 생체내의 확산을 계량. 이 방법은 원래 종양의 약물 민감도를 수치 미래에 사용될 수 있습니다. 이것은 현재 사용되는 셀 라인보다 예측 모델을 제공할 수 있습니다.
Protocol
1. 랫 뒷면에서 콜라겐을 추출
- 70 % 에탄올에 냉동 신선한 쥐의 꼬리를 놓습니다.
- 메스 노출 힘줄과 overlying 피부를 Deglove.
- 멀리 꼬리와 소독을 70 % 에탄올의 장소에서 힘줄을 스트립.
- 수집 힘줄과 초산 (250ml 0.5M 초산에 1g의 힘줄)로 전송을 나가는거야. 4 48hr에 대한 믹스 ° C.
- 30 분 대한 1만g에 힘줄이 / 아세트산 혼합물을 원심 분리기와 펠렛을 삭제.
- 뜨는 10 %의 동일한 부피 (W / V) NaCl을 추가하고 혼합 4에서 하룻밤 서있게 ° C.
- G. 10,000에서 추가로 30 분 대한 콜라겐이 풍부한, 불용성 아래 레이어와 centrifugate를 수집
- 4 0.25M 초산에있는 콜라겐이 풍부한 재료 ° C를 Resuspend 두 번 매일 투석 버퍼를 변경, 3 일 동안 4 ° C에서 1:1000 초산에 대한 dialyse.
- 또한 4 원심 분리 (2 시간에 대한 2만그램)과 저장하여 콜라겐 솔루션을 소독 ° C.
- 1mg/ml의 재고 농도로 멸균 1:1000 초산의 추가로 필요한 콜라겐을 희석.
2. 3D 분석 작성
3D 분석은 세포 라인 분석을 기반으로, 이전에이 게시되었습니다.
- 다중 코어 biopsies는 침입 유방암에 대한 치료 수술 절제술시 환자 동의에서 수확하고 있습니다.
- 눈으로, 1mm 3 조각으로 메스를 사용하여 코어를 나눕니다. 트림 및 macroscopically 별개의 지방을 삭제.
- MEGM 완료 언론의 조각을 담가. 조직은 최대 1 시간까지이 상태로 저장할 수 있습니다.
- 얼음 1mg/ml 랫 꼬리 콜라겐에있는 콜라겐 젤, 믹스를 생성하려면, 1:1000 필터링 초산, 3:5:1:1의 비율 10X DMEM/F12 및 0.22M NaOH 0.3의 최종 콜라겐 농도를 만들 수 MG / ML.
- 37 인큐베이터에 24 잘 접시와 장소 개별 우물에 콜라겐 혼합의 1.2ml를 주사 ° C를 10 분 대한 겔화를 시작합니다.
- 10 분 후 인큐베이터에서 24 잘 플레이트를 제거합니다. 겔화 콜라겐에 종양의 조각을 놓고 부드럽게 10μl 피펫 팁을 사용하여 젤의 중심에 그들을 밀어. 1 시간을위한 인큐베이터에 24 잘 번호판을 반환합니다.
- ER + 종양 들어, 3.2x10 -10 M.의 농도 β - oestradiol와 MEGM 완전한 미디어를 보완 겔 assays는 1 시간에 대한 gelled 후에는 신중하게 각 우물에 보충 미디어 1.2ml 소개합니다. 검정 내에서 최종 β - oestradiol 농도는 유방 조직 3 발견 생리 에스 트로겐 수준을 요점을 되풀이하는 1.6x10 -10 M에 equilibriate 것입니다.
- 따라서 각 젤 미디어 내에서 자유롭게 부동 수 있도록 circumferentially 각 젤 발표 각 우물의 안쪽 가장자리 주위에 10μl 피펫 팁을, 실행합니다. 인큐베이터에 24 잘 번호판을 반환합니다.
- Exchange는 실험 종료까지 미디어가 두 번 주간 보충. 미디어를 제거하고 포르말린 정착액을 추가하여 실험을 종료할 수 있습니다.
3. 광학 프로젝션 Tomography 준비 어세이의 항체 스테 이닝
우리는 전체 샘플 얼룩의 4 이전에 게시된 방법을 채택했습니다.
- PBS로 30 분 대한 포르말린 고정 표본 씻으십시오. 각 단계에서 33% 66 %, 그리고 ≥ 15 100 % PBS는 0.05 % 트윈 20 (0.05 % PBST)을 포함하는으로 희석 메탄올에 stepwise 젤을 탈수.
- DMSO : : 30 % H 2 autofluorescence를 끄지을 이용하려면에 대해 실온에서 2시 1분 3초의 비율 (15 % V / V H 2 O 2)에서 O 2 신선한 MeOH의 조직을 품어.
- 메탄올에 30 분에 두 샘플을 씻으십시오. -80 ° C 조직의 깊은 부분에 항원을 보장하기 위해 실내 온도 (RT)로 적어도 1 시간마다 시간을위한 다섯 시간이 렌더링에 액세스할 수있는 샘플을 고정.
- 희석제 (각 단계에서 33% 66 % 및 15에 대한 100 %)로 메탄올과 다시 0.05 %의 PBST로 조직을 Rehydrate.
- 이용하려면에 대한 솔루션 (0.05 %의 PBST에서 혈청 10 %) 차단의 조직을 차단합니다.
- 48hr 5 % DMSO를 포함 차단 솔루션 1.5ml에 희석 1:500의 농도에 방지 cytokeratin 토끼를 사용하여 상피 내용을 식별하는 기본 항체로 조직을 품어.
- 30 분 각각에 대해 0.05 %의 PBST로 샘플 네 번이나 씻으십시오.
- 48hr 5 %의 DMSO를 포함 1.5ml 차단 솔루션에 희석 형광등 보조 항체 (1:100 염소 방지 - 토끼 Alexa555)로 조직을 품어.
- 30 분 각각 0.05 % PBST 네번로 다시 샘플을 씻으십시오.
4. 광학 프로젝션 Tomography
광학 프로젝션 tomography는 최대 15mm 5의 두께 형광 생물 학적 표본의 고해상도 3D 이미지를 생산하기 이전에 개발된 현미경 기법입니다.
- S 마운트tained 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스 겔 및 이용하려면에 대한 100 % 메탄올로 탈수. 48hr에 대한 밥 솔루션 (1시 2분 벤질 알코올, 벤질 벤조 산)의 표본을 해제하고 OPT 3001M 스캐너 (Bioptonics)을 사용하여 검사합니다.
- 대상 및 autofluorescence 모두 Cy3 필터 세트 (자극 545nm/30 NM, 에미터 75분의 610 NM)와 각각 GFP1 필터 세트 (자극 425nm/40 NM, 에미터 LP475 NM)을 사용하여 캡처합니다.
5. 재건 및 3D의 부량
- OPT 인수 각도 예측의 집합은 침공 분석을 통해 단면 슬라이스 일련의를 만드는 NRecon 소프트웨어 (SkyScan)를 사용하여 복원 수 있습니다. 이 소프트웨어에서 무료로 다운로드할 수 있습니다 http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
- Volocity 소프트웨어 (PerkinElmer)를 사용하여 복원 데이터를 Analyse. 무료 데모 소프트웨어는 다음 위치에서 다운로드할 수 있습니다 http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
- cytokeratin 얼룩으로 상피 볼륨을 계량하기 위해서는 대상 채널의 배경 형광의 간섭을 줄이기 위해 최소 voxel의 강도 임계값 설정합니다. 우리는 측정 어플 리케이션에서 사용할 수있는 매개 변수 목록을 사용하여 9000 프에서 경험적으로이 임계값을 정의, 우리는 원래의 핵심 (autofluorescent 채널에 demarcated)과 연속성에서 상피의 볼륨을 계량. 이것은 우리가 다른 사이의 상피 가지의 볼륨을 계량 수 종양 샘플.
6. 대표 결과 :
분석의 개발 과정, 52 유방암의 총 조직 병리학의 다양한 표본이 사용되었습니다 생검. 이들 중 <10 % (5 / 52) 적어도 하나의 가능한 공격 분석을 제공하지 못했습니다. 분석 실패도 위에 감염 세균이나 부족 종양 생검 재료에 의한했다. 따라서 분석의 응용 프로그램은 유방암의 특정 subtype에 제한되지 않습니다.
일반 assays (그림 1) 콜라겐 문화 20 일 후에 고정 및 이후 cytokeratin에 대한 얼룩. Volocity 소프트웨어는 원래의 핵심과 세포를 침해의 분리된 그룹과 지속적인 상피 대량을 모두 인식하고 개별적으로 각각의 볼륨을 정할 수 있습니다.
고정 및 부량 다음 그림 1. 침공 assays. 검정 여러 유방암 subtypes에서 얻은 샘플을 지원합니다) ER + B) HER2 + 및 C) ER -.
Discussion
암 세포 라인의 행동을 연구하는 콜라겐 기반 assays 지금은 널리 6,7,8를 사용하고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 assays는 종양과 환경의 전체 복잡에 반영하지 않았습니다. 본 연구에서는, 우리는 인간 유방암 자료는 유사한 방식으로, 전 생체내에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 또한, OPT는 유방암의 3D 확장을 특징하는 유용한 도구입니다. 우리는이 기술의 주요 한계는 종양 자료 (단일 코어 생검은 4-6 assays에 충분합니다)의 이용되고있는 것으로 나타났습니다. 또 다른 제한 요인은 구조적 침략은 assays의 약 40 %에서 발생합니다. 이것을 극복하기 위해, 우리는 정기적으로 보이는 성장과 모든 assays하는 일 7.2 주변에 원하는 치료를 추가합니다.
OPT의 사용은 또한 약물 치료로 인한 대량 변경, 전직의 생체내를 감지하는 미래의 확장 수 있습니다. 이 차례, 동물 모델의 독립보다 개별적인 암 치료를 용이하게 수 있습니다. 현재 tamoxifen 전직의 생체내에 ER + 종양의 반응을 탐구하고 있습니다.
Disclosures
바느질과 JF은 Bioptonics OPT 스캐너의 상용화는 MRC 기술에 의해 고용됩니다. 기타 저자 관심에 대한 갈등을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 임상 표본을 얻기 그녀의 귀중한 도움로나 랜쇼 (에딘버러 유방 단위)를 주셔서 감사합니다.
종양 소재의 이용은 로디언 연구 윤리위원회 (08/S1101/41)에 의해 승인되고 실험 암 의학 센터 프로그램 (에든버러)의 후원하에 얻은 것입니다.
이 작품은 스코틀랜드 기금위원회에 의해 지원됩니다. ADL은 미스 마가렛 버터 리키 신뢰 임상 사람이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGM Complete | Lonza Inc. | CC-3150 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8900 10X1L | |
| β-–stradiol | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | |
| Rabbit anti-cytokeratin | Dako | Z0622 | |
| Goat anti-rabbit Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
| All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich. | |||
References
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