Långsiktig kultur för mänskliga Prover bröstcancer och deras analys Använda optisk Projection Tomography

Summary

Vi har utvecklat en kollagenbaserade

Abstract

Bröstcancer är en ledande orsak till dödlighet i västvärlden. Det är väletablerat att spridningen av bröstcancer, först lokalt och sedan distalt, är en viktig faktor i patientens prognos. Experimentella system av bröstcancer är beroende av cellinjer vanligen erhålls från primära tumörer eller pleurautgjutning. Två stora faktorer som hindrar denna forskning: (i) vissa kända subtyper av bröstcancer (särskilt dålig prognos luminala B tumörer) inte är representerade inom aktuell rad samlingar, (ii) påverkan av tumören mikromiljön normalt inte beaktas.

Vi visar en teknik för att kultur primär exemplar bröstcancer av alla subtyper. Detta uppnås genom att använda tredimensionella (3D) kultur system där små bitar av tumör är inbäddade i mjukt råtta kollagen jag kuddar. Inom 2-3 veckor, tumörceller sprids i kollagen och bildar olika strukturer som liknar dem som observerats i mänskliga tumours1. Livskraftiga adipocyter var epitelceller och fibroblaster i den ursprungliga kärnan tydligt på histologi. Maligna epitelceller med squamoid morfologi visades invadera i den omgivande kollagen. Nuclear pleomorphism visade sig inom dessa celler, tillsammans med mitotiska siffror och apoptotiska kroppar.

Vi har anställt Optical Projection Tomography (OPT), en 3D-röntgen teknik, i syfte att kvantifiera omfattningen av tumören sprida sig i kulturen. Vi har använt OPT att mäta huvuddelen volymen av tumören kultur, en parameter mäts rutinmässigt under neo-adjuvant behandling av bröstcancerpatienter att bedöma svaret på läkemedelsbehandling.

Här presenterar vi en möjlighet att kultur humana brösttumörer utan subtyp partiskhet och kvantifiera spridningen av dem ex vivo. Denna metod skulle kunna användas i framtiden för att kvantifiera drog känslighet i ursprungliga tumören. Detta kan ge en mer prediktiv modell än som för närvarande används cellinjer.

Protocol

1. Extrahera kollagen från skolästfiskar

1. Placera frysta färska skolästfiskar i 70% etanol.
2. Deglove den överliggande huden med en skalpell utsätta senor.
3. Strip senor bort från svansen och placera i 70% etanol för att sterilisera.
4. Väg in senor och transfer till ättiksyra (1g senan till 250ml 0,5 ättiksyra). Blanda 48hr vid 4 ° C.
5. Centrifugera senan / ättiksyra blandas vid 10000 g under 30min och kasta pelleten.
6. Tillsätt en motsvarande volym på 10% (w / v) NaCl till supernatanten och låt blandningen stå över natten vid 4 ° C.
7. Samla kollagen-rika, olösliga understa lagret och centrifugat i ytterligare 30 min vid 10000 g.
8. Resuspendera kollagen-rika material i 0,25 m ättiksyra vid 4 ° C och dialysera mot 1:1000 ättiksyra vid 4 ° C under 3 dagar, byte av dialys bufferten två gånger dagligen.
9. Ytterligare sterilisera kollagen lösningen genom centrifugering (20.000 g för 2hr) och förvara vid 4 ° C.
10. Späd kollagen behov med tillägg av sterila 1:1000 ättiksyra ett bestånd koncentration av 1mg/ml.

2. 3D-analys Creation

3D-analysen är baserad på en cellinje analys, som publicerades tidigare ^2.

1. Flera kärna biopsier skördas från samtycker patienter vid kurativ kirurgisk resektion för invasiv bröstcancer.
2. Genom ögat, dela upp kärnorna med en skalpell i 1mm ³ fragment. Trim och kasta makroskopiskt distinkt fett.
3. Doppa bitarna i MEGM Komplett medier. Vävnaden kan lagras i detta tillstånd i upp till 1 timme.
4. För att skapa kollagen gel, blanda på is 1mg/ml råtta svans kollagen, till 1:1000 filtreras ättiksyra, 10x DMEM/F12 och 0.22M NaOH i förhållandet 3:5:1:1 skapa en slutlig kollagen koncentration av 0,3 mg / ml.
5. Injicera 1,2 ml av kollagen blandningen i enskilda brunnar i en 24 brunnar och placera i en inkubator vid 37 ° C i 10min att inleda geleringsmedel.
6. Efter 10min, ta ut 24 bra plattan från kuvösen. Placera tumören bitarna vidare till geleringsmedel kollagen och tryck försiktigt in dem till mitten av gelen med hjälp av en 10μl pipettspetsen. Returnera 24 brunnar till inkubatorn för 1 timme.
7. För ER + tumörer, komplettera MEGM Komplett media med β-östradiol till en koncentration av 3.2x10 ^-10 M. När gelen tester har geléartad för 1 timme, tillsätt försiktigt 1,2 ml av den kompletteras medier i varje brunn. Den slutliga β-östradiol koncentration analysen kommer equilibriate att 1.6x10 ^-10 M sammanfatta fysiologiska östrogen nivåer som finns i bröstvävnad ^3.
8. Kör en 10μl pipettspets runt innerkanten av varje brunn, frigöra varje gel runt om, så att varje gel att flyta fritt inom media. Returnera 24 brunnar till inkubatorn.
9. Börsen kompletteras media två gånger per vecka tills uppsägning av experimentet. Avsluta experimentet genom att ta bort media och lägga till en formalin fixativ.

3. Antikropp Infärgning av analys som förberedelse för Optisk Projektions Tomografi

Vi har antagit en tidigare publicerad metod för hela urvalet färgning ^4.

1. Tvätta formalin fasta prover för 30min i PBS. Torka av geler stegvis i metanol som spätts i PBS som innehåller 0,05% Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% och 100% för ≥ 15 min vid varje steg.
2. Inkubera vävnaden i nyberedda MeOH: DMSO: 30% H ₂ O ₂ i förhållandet 2:01:03 (15% v / v H ₂ O ₂₎ i rumstemperatur i 24 tim för att släcka autofluorescens.
3. Tvätta prov två gånger för 30min i metanol. Frysa proverna till -80 ° C fem gånger för åtminstone 1 timme varje gång och tillbaka till rumstemperatur (RT) för att säkerställa att antigener i de djupare delarna av vävnad är kan göras tillgängligt.
4. Rehydrera vävnaden tillbaka till 0,05% PBST med metanol som lösningsmedel (33%, 66% och 100% för 15min vid varje steg).
5. Blockera vävnad i blockerande lösningen (10% serum i 0,05% PBST) för 24h.
6. Inkubera vävnaden med primär antikropp för att identifiera de epiteliala innehåll, med kanin anti-Cytokeratin vid en koncentration av 1:500 utspädd i 1,5 ml för att blockera lösning som innehåller 5% DMSO för 48hr.
7. Tvätta prov fyra gånger med 0,05% PBST för 30min vardera.
8. Inkubera vävnaden med fluorescerande sekundär antikropp (1:100 get anti-kanin Alexa555), utspädd i 1,5 ml blockerande lösningen innehåller 5% DMSO för 48hr.
9. Tvätta proverna igen med 0,05% PBST fyra gånger för 30min vardera.

4. Optisk Projektions Tomografi

Optisk projektion tomografi är en mikroskopi teknik som tidigare utvecklats för att producera högupplösta 3D-bilder av fluorescerande biologiska prover med en tjocklek på upp till 15 millimeter ^5.

1. Montera sbehållas gel i 1% låg smältpunkt agaros och torka i 100% metanol för 24h. Rensa förlagan i Babb lösning (01:02 Bensylalkohol, bensylbensoat) för 48hr och skanna med hjälp av OPT 3001M Scanner (Bioptonics).
2. Både mål och autofluorescens har tagits med de Cy3 filtret set (Exciter 545nm/30 nm, emitter 610/75 nm) och GFP1 filter set (Exciter 425nm/40 nm, emitter LP475 nm) respektive.

5. Återuppbyggnad och 3D-kvantifiering

1. Uppsättningen av kantiga prognoser förvärvades av OPT kan rekonstrueras med hjälp av NRecon programvara (SkyScan) för att skapa en serie av tvärsnitt skär genom invasionen analysen. Denna programvara finns att ladda ned gratis på http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
2. Analysera rekonstruerade data med hjälp av Volocity programvara (PerkinElmer). Gratis demonstration programvara är tillgänglig för nedladdning på http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
3. För att kvantifiera epiteliala volym genom Cytokeratin färgning, fastställa en lägsta Voxel intensitet tröskeln för att minska störningar från bakgrunden fluorescens i målet kanal. Vi definierade denna tröskel empiriskt på 9000 au enligt en lista med tillgängliga parametrar i mätningen ansökan, kvantifieras vi volymen av epitel i kontinuitet med den ursprungliga kärnan (avgränsade i autofluorescent kanalen). Detta gjorde det möjligt för oss att kvantifiera volymerna av epitelceller utväxt mellan olika tumörprover.

6. Representativa resultat:

Under utvecklingen av analysen, totalt 52 bröstcancer biopsi prover med ett brett utbud av histopatologi använts. Av dessa <10% (5 / 52) misslyckades med att tillhandahålla minst ett livskraftigt invasion analys. Analysen felet berodde på antingen bakteriell supra-infektion eller otillräcklig tumör biopsimaterial. Därför tillämpning av analysen inte begränsas till en viss subtyp av bröstcancer.

Typiska tester (figur 1) fast efter 20 dagar i kollagen kultur och därefter färgas för Cytokeratin. Volocity programvara kan känna igen både epiteliala delen kontinuerligt med den ursprungliga kärnan och fristående grupper av invaderande celler och kvantifiera varje volym separat.

Figur 1. Invasion analyser efter fixering och kvantifiering. Analysen stöder prover från flera olika subtyper bröstcancer: a) ER + b) HER2 + och c) ER-.

Discussion

Kollagen-baserade analyser för att studera beteende cancercellinjer är nu allmänt används ^6,7,8. Icke desto mindre har dessa tester återspeglas inte fullt ut komplexiteten av tumören och dess miljö. I denna studie visar vi att mänskliga bröstcancer material kan användas på ett liknande sätt, ex vivo. Dessutom är OPT ett användbart verktyg för att karakterisera 3D utbyggnaden av bröstcancer. Vi fann att den främsta begränsningen av denna teknik är tillgången på tumören material (en enkel kärna biopsi räcker för 4-6 analyser). En annan begränsande faktor är att de strukturella invasionen förekommer endast i cirka 40% av analyser. För att lösa detta lägger vi regelbundet önskad behandling runt dag 7 till alla analyser med synlig tillväxt.

Användningen av OPT skulle kunna utvidgas i framtiden för att också upptäcka bulk förändringar, ex vivo, till följd av läkemedelsbehandling. Detta i sin tur kan underlätta en mer individualiserad cancerbehandling, oberoende av djurmodeller. Vi är för närvarande undersöker svar ER + tumörer med tamoxifen ex vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEGM Complete	Lonza Inc.	CC-3150
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8900 10X1L
β-–stradiol	Sigma-Aldrich	E8875-250MG
Rabbit anti-cytokeratin	Dako	Z0622
Goat anti-rabbit Alexa555	Invitrogen	A21422
All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich.