Summary
Мы разработали коллагена основе
Abstract
Рак молочной железы является одной из ведущих причин смертности в западном мире. Хорошо известно, что распространение рака молочной железы, в первую локально, а затем дистально, является основным фактором пациента прогноз. Экспериментальные системы рака молочной железы зависят от клеточных линий обычно выводятся из первичных опухолей или плевральный выпот. Два основных проблем, препятствующих этого исследования: (I) некоторые известные подтипы рака молочной железы (в частности, плохой прогноз просвета опухолей B) не представлены в рамках существующих коллекций линии; (II) влияния микроокружения опухоли обычно не принимается во внимание.
Мы показываем технику к культуре первичный рак молочной железы образцов всех подтипов. Это достигается с помощью трехмерной (3D) системе культуры, в которой небольшие кусочки опухоли, внедренных в мягкой коллагена крысы я подушки. В течение 2-3 недель, раковые клетки распространились на коллаген и образуют различные структуры, подобные тем, которые наблюдаются в человеческом tumours1. Жизнеспособных адипоцитов, эпителиальные клетки и фибробласты в первоначальное ядро было видно на гистологию. Злокачественные эпителиальные клетки с squamoid морфологии были продемонстрированы вторжение в окружающие коллагена. Ядерная плеоморфизм было очевидно внутри этих клеток, наряду с фигурами митоза и апоптоза органов.
Мы использовали оптический томограф Projection (ОПТ), 3D-технологии обработки изображений, для того, чтобы количественно степень распространения опухоли в культуре. Мы использовали OPT для измерения объемной объема опухоли культуры, параметр обычно измеряется в нео-адъювантной терапии больных раком молочной железы для оценки ответа на лекарственную терапию.
Здесь мы представляем возможность культуры опухолей человеческой груди без подтип смещения и количественно распространения этих бывших естественных условиях. Этот метод может быть использован в будущем для количественного лекарственной чувствительности в оригинальной опухоли. Это может обеспечить более прогнозной модели, чем в настоящее время используются клеточные линии.
Protocol
1. Извлечение из коллагена крысиные хвосты
- Место замороженные свежие хвосты крыс в 70% этанола.
- Deglove вышележащих кожу скальпелем подвергая сухожилий.
- Газа сухожилия от хвоста и место в 70% этилового спирта для стерилизации.
- Взвесьте собраны сухожилий и передачи в уксусную кислоту (1 г на 250 мл сухожилия 0,5 М уксусной кислоты). Смесь для 48hr при 4 ° C.
- Центрифуга сухожилия / уксусной кислоты смешиваются в 10000 г в течение 30 минут и отбросить гранул.
- Добавить равный объем 10% (м / о) NaCl в супернатант и позволяет смешивать на ночь при 4 ° C.
- Сбор коллаген богатые, нерастворимые нижний слой и центрифугата для дальнейших 30 минут при 10000 g.
- Ресуспендируют коллагена богатый материал в 0,25 М уксусной кислоты при температуре 4 ° С и диализировать против 1:1000 уксусной кислоты при температуре 4 ° С в течение 3 дней, меняя диализа буфера дважды в день.
- Далее стерилизации раствора коллагена путем центрифугирования (20000 г на 2ч) и хранить при 4 ° C.
- Развести коллаген по мере необходимости с добавлением стерильной 1:1000 уксусной кислоты фондовом концентрации 1mg/ml.
2. 3D Пробирной Создание
3D-анализ основан на анализе клеточной линии, опубликованные ранее 2.
- Множественные биопсии ядро собирают с согласия пациента во время лечебных хирургическая резекция инвазивного рака молочной железы.
- В глаза, разделите ядра с помощью скальпеля в 1 мм 3 фрагменты. Обрежьте и удалите макроскопически различимых жира.
- Погрузите фрагментов в MEGM Полное СМИ. Ткани могут сохраняться в таком состоянии до 1 час.
- Чтобы создать коллагеновый гель, смешать со льдом 1mg/ml коллагена хвоста крысы, 1:1000 фильтруется уксусной кислоты, 10x DMEM/F12 и 0.22M NaOH в соотношении 3:5:1:1 для создания конечной концентрации коллагена в 0,3 мг / мл.
- Inject 1.2ml коллагена смесь на отдельные лунки 24-луночного планшета и поместить в инкубатор при 37 ° С в течение 10 минут для начала гелеобразования.
- После 10 минут, удалите 24-луночного планшета из инкубатора. Место опухоли частей на гелеобразования коллагена и аккуратно вставьте их к центру гель использованием 10 мкл кончиком пипетки. Возвращение 24-луночный планшет для инкубатора для 1 час.
- Для ER + опухоли, дополнять MEGM Полное сред с β-эстрадиола в концентрации 3.2x10 -10 М. Как только гель анализы загущенное на 1 час, осторожно ввести в 1.2ml дополнен СМИ в каждую лунку. Окончательный β-эстрадиола концентрация в анализе будет equilibriate к 1.6x10 -10 М, чтобы резюмировать физиологического уровня эстрогенов обнаружены в ткани молочной железы 3.
- Выполнить 10 мкл кончика пипетки вокруг внутреннего края каждой лунки, выпуская каждый гель окружности, тем самым позволяя каждому гель свободно плавать в средствах массовой информации. Возвращение 24-луночный планшет для инкубатора.
- Биржа дополнен СМИ два раза в неделю до прекращения эксперимента. Завершить эксперимент, удалив средствами массовой информации и добавления формалина фиксатором.
3. Антитела Окрашивание Пробирной в рамках подготовки к оптической томографии Проекция
Мы приняли ранее опубликованных метод целых 4 окрашивания образца.
- Вымойте формалин фиксированных экземпляров в течение 30 минут в PBS. Дегидрировать гели поэтапно в метаноле разводят в PBS, содержащем 0,05% Твин-20 (0,05% PBST): 33%, 66% и 100% в течение ≥ 15 минут на каждом шагу.
- Инкубируйте ткани в свежеприготовленный MeOH: ДМСО: 30% H 2 O 2 в соотношении 2:01:03 (15% об. / H 2 O 2) при комнатной температуре, чтобы утолить 24hr аутофлюоресценция.
- Вымойте образцы дважды в течение 30 минут в метаноле. Замораживание образцов до -80 ° С в пять раз, по крайней мере 1 час и каждый раз до комнатной температуры (RT), чтобы обеспечить антигенов в более глубокие части ткани оказываются доступными.
- Увлажняет ткань обратно до 0,05% PBST с метанолом в качестве разбавителя (33%, 66% и 100% в течение 15 минут на каждом шагу).
- Блок ткани в блокировании решения (10% сыворотки в 0,05% PBST) для 24hr.
- Инкубируйте ткани с первичного антитела для выявления эпителиальных содержания, с помощью кроличьих анти-цитокератин в концентрации 1:500 разводят в 1,5 мл блокировки раствора, содержащего 5% ДМСО для 48hr.
- Вымойте образцы в четыре раза с 0,05% PBST в течение 30 минут каждый.
- Инкубируйте ткани с люминесцентным вторичные антитела (1:100 Коза анти-кролик Alexa555), разводят в 1,5 мл раствора, содержащего блокирующий 5% ДМСО для 48hr.
- Вымойте образцы снова с 0,05% PBST четыре раза в течение 30 минут каждый.
4. Оптическая томография Проекция
Оптическая томография проекция микроскопии ранее разработанных для получения высокого разрешения, 3D-изображений флуоресцентных биологических образцов с толщиной до 15 мм 5.
- Горы сtained геля в 1% низкой температурой плавления агарозы и обезвоживают в 100% метанола для 24hr. Очистить образца в Бабб решение (1:2 бензилового спирта, бензилбензоата) для 48hr и сканирования с помощью сканера ОПТ 3001M (Bioptonics).
- Обе цели и аутофлюоресценция, получены с помощью Cy3 набор фильтров (возбудитель 545nm/30 нм, эмиттер 610/75 нм) и GFP1 набор фильтров (возбудитель 425nm/40 нм, эмиттер LP475 нм) соответственно.
5. Реконструкция и 3D количественного
- Набор угловых проекций, приобретенных ОПТ может быть восстановлена с использованием NRecon программное обеспечение (SkyScan), чтобы создать серию крест ломтиками разрез вторжения анализа. Это программное обеспечение доступно для бесплатного скачивания на http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
- Анализ данных с помощью реконструированных Volocity программное обеспечение (PerkinElmer). Свободное программное обеспечение демонстрации доступна для скачивания на http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
- Для того, чтобы количественно эпителиальных объеме цитокератин окрашивания, установить минимальный порог интенсивности воксела для уменьшения помех от фоновой флуоресценции в целевой канал. Мы определили этот порог эмпирически при 9000 а.е. Использование списка доступных параметров в измерении приложения, мы количественно объема эпителия в преемственности с оригинальным ядром (разграничены в autofluorescent канал). Это позволило количественно объемы эпителиальных нарост между различными образцов опухоли.
6. Представитель Результаты:
В ходе разработки теста, в общей сложности 52 рака молочной железы биопсии с широким спектром гистопатология были использованы. Из них <10% (5 / 52) не в состоянии обеспечить хотя бы один жизнеспособный анализ вторжения. Анализ ошибка произошла вследствие либо бактериальной инфекции или недостаточной биопсии опухоли материала. Поэтому применение данного метода не ограничивается конкретным подтипа рака молочной железы.
Типичные анализы (рис. 1) фиксированная через 20 дней в коллагене культуры, а затем окрашивают в течение цитокератин. Volocity программное обеспечение распознает оба эпителиальных масса непрерывно первоначальное ядро и отдельные группы вторжения в клетки и количественной оценки каждого тома отдельно.
Рисунок 1. Вторжение анализов после записи и количественное. Анализ поддерживает образцов, полученных из различных подтипов рака молочной железы:) ER + б) HER2 + и в) ER-.
Discussion
Коллаген основе анализов для изучения поведения линий раковых клеток в настоящее время широко использовали 6,7,8. Тем не менее, эти тесты не отражены в полной сложности опухоли и ее окружения. В этом исследовании мы показали, что человеческий материалов рака молочной железы могут быть использованы аналогичным образом, экс естественных условиях. Кроме того, ОПТ является полезным инструментом для описания 3D расширение рака молочной железы. Мы обнаружили, что основным ограничением этого метода является наличие опухоли материалов (одноядерный биопсии достаточно для 4-6 анализов). Другим сдерживающим фактором является то, что структурные вторжения происходит только в 40% проб. Чтобы преодолеть это, мы регулярно добавлять любое желаемое лечение около 7-й день, чтобы все анализы с видимым ростом.
Использование ОПТ может быть продлен в будущем также обнаружить массовые изменения, экс живом организме, в результате медикаментозного лечения. Это, в свою очередь, может способствовать более индивидуализированные терапии рака, независимо от животных моделях. Настоящее время мы изучаем реакцию ER + опухолей естественных тамоксифен отл.
Disclosures
SEW и JF являются сотрудниками MRC технологии, которая коммерциализации Bioptonics ОПТ сканеров. Другие авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Лорна Реншоу (Эдинбург груди Unit) за неоценимую помощь в получении клинических образцов.
Использование опухоли материал был одобрен Лотиан исследования Комитета по этике (08/S1101/41) и получил под эгидой Экспериментальной медицины Рак центр программы (Эдинбург).
Эта работа проводится при поддержке Совета шотландского финансирования. ADL является мисс Маргарет Баттерс Reekie целевой клинической парень.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGM Complete | Lonza Inc. | CC-3150 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8900 10X1L | |
| β-–stradiol | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | |
| Rabbit anti-cytokeratin | Dako | Z0622 | |
| Goat anti-rabbit Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
| All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich. | |||
References
- Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology. 57, 171-192 (2010).
- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).
- Dabrosin, C. Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle. J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Hidalgo-Carcedo, C. Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6. Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).
- Katz, E. A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk. Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).
- Timpson, P. Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53. Cancer Res. 71, 747-757 (2011).
