Summary
Wir haben eine Kollagen-basierten entwickelt
Abstract
Brustkrebs ist eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit in der westlichen Welt. Es ist bekannt, dass die Ausbreitung von Brustkrebs, zunächst lokal und dann distal, ist ein wichtiger Faktor in die Prognose der Patienten. Experimental-Systeme von Brustkrebs vertrauen auf Zell-Linien in der Regel von Primärtumoren oder Pleuraergüsse abgeleitet. Zwei große Hindernisse stehen dieser Forschung: (i) einige bekannte Sub-Typen von Brustkrebs (vor allem schlechte Prognose luminalen B Tumoren) nicht innerhalb der aktuellen Zeile Sammlungen vertreten; (ii) den Einfluss der Tumor-Mikroumgebung in der Regel nicht berücksichtigt.
Wir demonstrieren eine Technik zur Kultur primärem Mammakarzinom Proben aller Sub-Typen. Dies wird durch die dreidimensionale (3D-) Kultur, in dem kleine Stücke des Tumors in weichen Ratte Kollagen I Kissen eingebettet sind erreicht. Innerhalb von 2-3 Wochen, die Tumorzellen in das Kollagen verteilt und bilden verschiedene Strukturen ähnlich denen in der menschlichen tumours1 beobachtet. Tragfähige Adipozyten wurden Epithelzellen und Fibroblasten in den ursprünglichen Kern der Histologie evident. Bösartige Epithelzellen mit squamoid Morphologie wurden gezeigt Invasion in das umgebende Kollagen. Kernpolymorphie war in diesen Zellen evident, zusammen mit Mitosen und apoptotische Körper.
Wir haben Optical Projection Tomographie (OPT), ein 3D-Imaging-Technologie, eingesetzt, um das Ausmaß der Tumorausbreitung in Kultur zu quantifizieren. Wir haben OPT verwendet werden, um den Großteil Volumen des Tumors Kultur zu messen, einen Parameter routinemäßig während der neo-adjuvanten Behandlung von Brustkrebs-Patientinnen gemessen werden, um als Reaktion auf medikamentöse Therapie zu beurteilen.
Hier präsentieren wir die Gelegenheit, Kultur menschlichen Brusttumoren ohne sub-type Bias und zu quantifizieren, die Ausbreitung dieser ex vivo. Diese Methode könnte in der Zukunft genutzt werden, um Drogen-Empfindlichkeit in ursprünglichen Tumor zu quantifizieren. Dies kann einen besseren prädiktiven Modells als derzeit verwendete Zelllinien.
Protocol
1. Extrahieren von Collagen aus Rattenschwänzen
- Legen Sie gefrorenes Frischplasma Rattenschwänzen in 70% Ethanol.
- Deglove die darüber liegende Haut mit einem Skalpell auszusetzen Sehnen.
- Streifen Sehnen weg vom Schwanz und in 70% Ethanol zu sterilisieren.
- Wiegen Sie die gesammelten Sehnen und Transfer zu Essigsäure (1g Sehne 250ml 0,5 M Essigsäure). Mix für 48hr bei 4 ° C.
- Centrifuge die Sehne / Essigsäure-Mix bei 10.000 g für 30min und entsorgen Sie die Pellets.
- Fügen Sie dem gleichen Volumen 10% (w / v) NaCl, um den Überstand und lassen Sie die Mischung über Nacht stehen bei 4 ° C.
- Sammeln Sie die Kollagen-reich, unlöslich Bodenschicht und Zentrifugat für weitere 30 Minuten bei 10.000 g.
- Resuspendieren Kollagen-reiches Material in 0,25 M Essigsäure bei 4 ° C und Dialyse gegen 1:1000 Essigsäure bei 4 ° C für 3 Tage, Wechsel der Dialyse-Puffer zweimal täglich.
- Weitere sterilisieren Kollagenlösung durch Zentrifugation (20.000 g für 2 Std.) und lagern bei 4 ° C.
- Verdünnen Kollagen mit der Zugabe von sterilem 1:1000 Essigsäure auf einen Bestand Konzentration von 1mg/ml erforderlich.
2. 3D-Assay Creation
Die 3D-Test auf eine Zelllinie Assay basiert, veröffentlicht bisher 2.
- Mehrere Stanzbiopsien aus zustimmenden Patienten zum Zeitpunkt der kurativen Resektion für invasiven Brustkrebs geerntet.
- Mit Auge, teilen sich die Kerne mit einem Skalpell in 1mm 3 Fragmente. Trim und entsorgen makroskopisch deutlich Fett.
- Tauchen Sie die Fragmente in MEGM Komplett Media. Das Gewebe kann in diesem Zustand gelagert werden bis zu 1 Stunde.
- Zum Erstellen der Kollagen-Gel, auf Eis 1mg/ml Rattenschwanz Collagen, bis 1:1000 gefiltert Essigsäure, 10x DMEM/F12 und 0,22 M NaOH in einem Verhältnis von 3:5:1:1 erstellen eine abschließende Kollagen-Konzentration von 0,3 mg / ml.
- Inject 1.2ml von Kollagen-Gemisch in die einzelnen Wells einer 24-Well-Platte aufnehmen und in einem Brutschrank bei 37 ° C für 10 Minuten, um ein Gelieren zu initiieren.
- Nach 10min, entfernen Sie den 24-Well-Platte aus dem Inkubator. Ort des Tumors Stücke auf die Gelier-Kollagen und schieben sie in die Mitte des Gels mit einem 10 &mgr; l Pipettenspitze. Gibt die 24-Well-Platte in den Inkubator für 1 Stunde.
- Für ER + Tumore, zu ergänzen MEGM komplette Medien mit β-Östradiol zu einer Konzentration von 3.2x10 -10 M. Nachdem das Gel Assays für 1 Stunde haben geliert, sorgfältig einführen 1.2ml der ergänzten Medien in jedes Well. Die endgültige β-Östradiol-Konzentration im Assay wird 1.6x10 -10 M equilibriate auf physiologische Östrogenspiegel im Brustgewebe 3 gefunden zu rekapitulieren.
- Führen Sie einen 10 &mgr; l Pipettenspitze um den inneren Rand jeder gut, die Freigabe jedes Gel Umfang, so dass jedes Gel frei schweben in den Medien. Gibt die 24-Well-Platte in den Inkubator.
- Börse ergänzt Medien zweimal wöchentlich bis zur Beendigung des Experiments. Beenden Sie den Versuch durch Entfernen von Medien und das Hinzufügen einer Formalin Fixativ.
3. Antikörper-Färbung von Assay in Vorbereitung für Optical Projection Tomographie
Wir haben eine zuvor veröffentlichte Methode zur gesamten Stichprobe Färbung 4 angenommen.
- Wash Formalin fixierten Proben für 30min in PBS. Entwässern der Gele schrittweise in Methanol in PBS mit 0,05% Tween 20 (0,05% PBST) verdünnt: 33%, 66% und 100% für ≥ 15min bei jedem Schritt.
- Inkubieren des Gewebes in frisch zubereiteten MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 in einem Verhältnis von 02.01.03 (15% v / v H 2 O 2) bei Raumtemperatur für 24 Stunden auf die Autofluoreszenz zu stillen.
- Wash-Proben zweimal für 30 Minuten in Methanol. Einfrieren der Proben bis -80 ° C fünf Mal für mindestens 1 Stunde jedes Mal und wieder auf Raumtemperatur (RT) auf, die Antigene in den tieferen Teilen des Gewebes gewährleistet werden zugänglich gemacht.
- Rehydrieren das Gewebe wieder auf 0,05% PBST mit Methanol als Verdünnungsmittel (33%, 66% und 100% für 15 Minuten bei jedem Schritt).
- Block des Gewebes in Blocking-Lösung (10% Serum in 0,05% PBST) für 24 Stunden.
- Inkubieren des Gewebes mit primärer Antikörper gegen das epitheliale Inhalt zu identifizieren, mit Kaninchen-Anti-Cytokeratin in einer Konzentration von 1:500 in 1,5 ml der Sperrung Lösung mit 5% DMSO für 48hr verdünnt.
- Wash Proben viermal mit 0,05% PBST 30 min je.
- Inkubieren des Gewebes mit fluoreszierenden sekundären Antikörper (1:100 Ziege Anti-Kaninchen-Alexa555), in 1,5 ml Blocking-Lösung mit 5% DMSO für 48hr verdünnt.
- Waschen Sie die Proben wieder mit 0,05% PBST viermal für jeweils 30 Minuten.
4. Optical Projection Tomographie
Optische Projektions-Tomographie ist ein Mikroskopie-Technik bereits entwickelt, um hochauflösende 3D-Bilder von fluoreszierenden biologischen Proben mit einer Dicke von bis zu 15 Millimeter 5 zu erzeugen.
- Montieren Sie die stained Gel in 1% Agarose für niedrigen Schmelzpunkt und entwässern in 100% Methanol für 24 Stunden. Deaktivieren Sie die Probe in BABB Lösung (1:2 Benzylalkohol, Benzylbenzoat) für 48hr und scannen mit dem OPT 3001M Scanner (Bioptonics).
- Sowohl Ziel-und Autofluoreszenz erfasst mit dem Cy3-Filtersatz (Erreger 545nm/30 nm, Emitter 610/75 nm) und GFP1 Filter-Set (Erreger 425nm/40 nm, Emitter LP475 nm) bzw..
5. Wiederaufbau-und 3D-Quantifizierung
- Der Satz von eckigen Projektionen OPT erworbene rekonstruiert mit NRecon Software (SkyScan) zu einer Reihe von Querschnitt schneidet durch die Invasion Assay zu erzeugen. Diese Software ist für Sie kostenlos bei Download http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
- Analyse der rekonstruierten Daten mit Volocity Software (PerkinElmer). Kostenlose Demo-Software ist zum Download verfügbar unter http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
- Um epithelialen Volumen von Zytokeratin-Färbung zu quantifizieren, stellen ein Minimum Voxel Intensität Schwelle für Störungen durch Hintergrundfluoreszenz in der Ziel-Kanal zu reduzieren. Wir definierten diese Schwelle empirisch bei 9000 au Mit einer Liste der verfügbaren Parameter in der Messaufgabe, wir das Volumen des Epithels in Kontinuität mit dem ursprünglichen Kern (abgegrenzt im autofluoreszierenden Kanal) quantifiziert. Dies erlaubt uns zu einem Volumen von epithelialen Auswuchs zwischen verschiedenen quantifizieren Tumorproben.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Bei der Entwicklung des Tests, Biopsie insgesamt 52 Brustkrebs Proben mit einer breiten Palette von Histopathologie verwendet wurden. Von diesen <10% (5 / 52) nicht mindestens eine tragfähige Invasion Assay liefern. Assay Misserfolg war entweder aufgrund bakterieller supra-Infektion oder unzureichende Tumor Biopsie-Material. Deshalb Anwendung des Tests ist nicht an einen bestimmten Subtyp von Brustkrebs beschränkt.
Typische Assays (Abbildung 1) nach 20 Tagen in Kollagen Kultur fixiert und anschließend für Cytokeratin gefärbt. Volocity Software ist in der Lage, sowohl die epithelialen Masse kontinuierlich mit dem ursprünglichen Kern und freistehende Gruppen von eindringenden Zellen zu erkennen und zu quantifizieren, jedes Volume separat.
Abbildung 1. Invasion Assays folgende Fixierung und Quantifizierung. Der Test unterstützt Proben aus verschiedenen Brustkrebs-Subtypen erhalten: a) ER + b) HER2 + und c) ER-.
Discussion
Collagen-basierte Assays, um das Verhalten von Krebszelllinien Studie sind jetzt weit 6,7,8 verwendet. Dennoch haben diese Tests nicht in vollem Umfang die Komplexität des Tumors und seiner Umgebung wider. In dieser Studie zeigen wir, dass menschliche Brustkrebszellen Materialien in ähnlicher Weise, ex vivo eingesetzt werden kann. Darüber hinaus ist OPT ein nützliches Werkzeug, um die 3D-Erweiterung von Brustkrebs zu charakterisieren. Wir fanden, dass die wichtigste Einschränkung dieser Technik die Verfügbarkeit von Tumor-Materialien (a Single-Core-Biopsie ist ausreichend für 4-6 Assays) ist. Ein weiterer limitierender Faktor ist, dass strukturelle Invasion tritt nur in etwa 40% des Assays. Um dies zu überwinden, wir regelmäßig add beliebige Behandlung um Tag 7, um alle Tests mit sichtbarem Wachstum.
Der Einsatz von OPT könnte in der Zukunft erweitert werden, um auch erkennen, Bulk-Änderungen, ex vivo, die sich aus medikamentöser Behandlung. Dies wiederum könnte zu erleichtern stärker individualisierten Krebstherapie, unabhängig von Tiermodellen. Wir prüfen derzeit die Antwort der ER + Tumore auf Tamoxifen ex vivo.
Disclosures
SEW und JF von MRC-Technologie, welche die Kommerzialisierung Bioptonics OPT-Scanner eingesetzt wird. Andere Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken Lorna Renshaw (Edinburgh Breast Unit) für ihre unschätzbare Hilfe bei der Beschaffung von klinischen Proben.
Verwendung von Tumormaterial wurde von der Lothian Research Ethics Committee (08/S1101/41) zugelassen und erhältlich unter der Schirmherrschaft des Experimental Cancer Medicine Centre Programm (Edinburgh).
Diese Arbeit wird von der Scottish Funding Council unterstützt. ADL ist eine Miss Margaret Butters Reekie Vertrauen klinischen Kollegen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGM Complete | Lonza Inc. | CC-3150 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8900 10X1L | |
| β-–stradiol | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | |
| Rabbit anti-cytokeratin | Dako | Z0622 | |
| Goat anti-rabbit Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
| All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich. | |||
References
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- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).
- Dabrosin, C. Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle. J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).
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