Summary
Nous avons développé une base de collagène
Abstract
Le cancer du sein est une cause majeure de mortalité dans le monde occidental. Il est bien établi que la propagation du cancer du sein, d'abord localement et plus tard distalement, est un facteur majeur dans le pronostic du patient. Systèmes expérimentaux de cancer du sein s'appuient sur des lignées de cellules généralement tirées de tumeurs primaires ou un épanchement pleural. Deux obstacles majeurs entravent cette recherche: (i) certains sous-types connus de cancers du sein (notamment mauvais pronostic des tumeurs luminales B) ne sont pas représentés dans les collections de la ligne actuelle, (ii) l'influence du microenvironnement de la tumeur n'est généralement pas pris en compte.
Nous démontrons une technique pour la culture primaire spécimens de cancer du sein de tous les sous-types. Ceci est réalisé en utilisant trois dimensions du système de culture (3D) dans lequel de petits morceaux de tumeur sont intégrés dans le collagène chez le rat douce, je coussins. Dans 2-3 semaines, la propagation des cellules tumorales dans le collagène et la forme des différentes structures similaires à celles observées dans tumours1 humaine. Adipocytes viables, les cellules épithéliales et les fibroblastes au sein du noyau originel étaient évidentes sur l'histologie. Cellules épithéliales malignes avec une morphologie squamoid ont démontré l'invasion dans le collagène environnant. Pléomorphisme nucléaire était évidente au sein de ces cellules, avec des figures de mitose et de corps apoptotiques.
Nous avons utilisé la tomographie optique de projection (OPT), une technologie d'imagerie 3D, afin de quantifier l'ampleur de la propagation de la tumeur dans la culture. Nous avons utilisé l'OPT pour mesurer le volume en vrac de la culture tumeur, un paramètre couramment mesurés durant le traitement néo-adjuvant du cancer du sein pour évaluer la réponse au traitement médicamenteux.
Ici, nous présentons une occasion pour les tumeurs du sein de la culture humaine sans sous-type et de quantifier les biais de la propagation de ces ex vivo. Cette méthode pourrait être utilisée à l'avenir afin de quantifier la sensibilité au médicament dans la tumeur d'origine. Cela peut fournir un modèle plus prédictif que des lignées cellulaires utilisées actuellement.
Protocol
1. Extraction du collagène des queues de rat
- Placez congelés queues de rat frais dans l'éthanol à 70%.
- Deglove la peau recouvrant avec un scalpel, d'exposer les tendons.
- Bande tendons loin de la queue et sa place dans l'éthanol à 70% pour stériliser.
- Peser les tendons collectées et transfert à l'acide acétique (tendon 1g à 250ml d'acide acétique 0,5 M). Mélanger pendant 48 h à 4 ° C.
- Centrifuger le mélange d'acide tendon / acide acétique à 10.000 g pendant 30 minutes et jeter le culot.
- Ajouter un volume égal de 10% (p / v) de NaCl au surnageant et laisser le mélange reposer une nuit à 4 ° C.
- Recueillir les riche en collagène, couche inférieure insolubles et centrifugat pour une autre 30min à 10.000 g.
- Reprendre le collagène matière riche en acide acétique 0,25 M à 4 ° C et on dialyse contre 1:1000 acide acétique à 4 ° C pendant 3 jours, en changeant le tampon de dialyse deux fois par jour.
- En outre stériliser la solution de collagène par centrifugation (20000 g pour 2h) et stocker à 4 ° C.
- Diluer collagène tel que requis par l'ajout de l'acide acétique 1:1000 stériles à une concentration stock de 1mg/ml.
2. Création Assay 3D
Le test 3D est basée sur un dosage de la lignée cellulaire, publiés précédemment 2.
- Biopsies multiples sont récoltées de patients consentants au moment de la résection chirurgicale curative pour cancer du sein invasif.
- Par les yeux, diviser les noyaux en utilisant un scalpel dans 1mm 3 fragments. Trim et jeter le gras macroscopiquement distincts.
- Plongez les morceaux dans les médias MEGM complète. Le tissu peut être stocké dans cet état jusqu'à 1h.
- Pour créer le gel de collagène, mélanger sur glace 1mg/ml collagène de queue de rat, l'acide filtrée 1:1000 acétique, 10x DMEM/F12 et 0,22 M de NaOH dans un rapport de 3:5:1:1 à créer une concentration de collagène finale de 0,3 mg / ml.
- Injecter 1,2 ml de mélange de collagène dans des puits individuels d'une plaque de 24 puits et la placer dans une étuve à 37 ° C pendant 10min pour initier la gélification.
- Après 10min, enlever la plaque de 24 puits de l'incubateur. Placez les morceaux de tumeur sur le collagène de gélification et délicatement les pousser dans le centre du gel en utilisant une pointe 10 ul pipette. Retour de la plaque à 24 puits à l'incubateur pendant 1 heure.
- Pour les tumeurs ER +, supplément MEGM média complet avec β-estradiol à une concentration de 3.2x10 -10 M. Une fois les tests de gel ont gélifié pour 1h, 1,2 ml introduire prudemment des médias complétées dans chaque puits. La finale β-oestradiol concentration dans le dosage sera s'équilibrer à 1.6x10 -10 M de récapituler les niveaux d'oestrogène physiologiques dans les tissus mammaires 3.
- Exécuter une pointe de pipette 10 ul autour du bord intérieur de chaque puits, libérant chaque gel circonférentiellement, permettant ainsi à chaque gel à flotter librement dans les médias. Retour de la plaque à 24 puits à l'incubateur.
- Bourse complété les médias deux fois par semaine jusqu'à la fin de l'expérience. Fin à l'expérience par la suppression des médias et en ajoutant un fixateur de formol.
3. Coloration des anticorps du dosage dans la préparation de la tomographie optique de projection
Nous avons adopté une méthode précédemment publiée pour 4 échantillons coloration entier.
- Lavez le formol échantillons fixés pendant 30min dans du PBS. Déshydrater les gels par étapes dans le méthanol dilué dans du PBS contenant 0,05% de Tween 20 (0,05% PBST): 33%, 66% et 100% pour ≥ 15min à chaque étape.
- Incuber les tissus fraîchement préparés MeOH: DMSO: 30% H 2 O 2 à un ratio de 02:01:03 (15% v / v H 2 O 2) à température ambiante pendant 24 heures pour étancher l'autofluorescence.
- Lavez échantillons à deux reprises pour 30min dans le méthanol. Congeler les échantillons à -80 ° C à cinq reprises au moins 1h à chaque fois et revenir à température ambiante (TA) pour s'assurer que les antigènes dans les parties les plus profondes du tissu sont rendus accessibles.
- Réhydrater les tissus Retour à PBST 0,05% avec du méthanol comme diluant (33%, 66% et 100% pour 15min à chaque étape).
- Bloquer le tissu dans une solution de blocage (10% de sérum dans le PBST 0,05%) pour 24 heures.
- Incuber le tissu avec l'anticorps primaire afin d'identifier le contenu épithéliales, en utilisant de lapin anti-cytokératine à une concentration de 1:500 dilué dans 1,5 ml de solution de blocage contenant 5% de DMSO pour 48h.
- Lavez échantillons quatre fois avec PBST 0,05% pendant 30 minutes chacun.
- Incuber le tissu avec fluorescentes anticorps secondaire (1:100 chèvre anti-lapin Alexa555), dilué dans une solution de blocage 1.5ml contenant du DMSO 5% pour 48h.
- Laver les échantillons à nouveau avec 0,05% PBST quatre fois pendant 30 minutes chacun.
4. Tomographie optique de projection
La tomographie optique de projection est une technique de microscopie précédemment développés pour produire des images haute résolution en 3D de spécimens biologiques fluorescentes avec une épaisseur allant jusqu'à 15 millimètres 5.
- Montez le scontenue dans un gel à 1% d'agarose à faible point de fusion et déshydrater dans le méthanol à 100% pour 24 heures. Effacer le spécimen à Babb solution (01h02 alcool benzylique, le benzoate de benzyle) pour 48h et de numérisation en utilisant le scanner OPT 3001M (Bioptonics).
- Les deux cibles et autofluorescence sont capturés en utilisant l'ensemble Cy3 filtre (l'excitateur 545nm/30 nm, émetteur 610/75 nm) et GFP1 ensemble de filtres (d'excitation 425nm/40 nm, émetteur LP475 nm) respectivement.
5. Reconstruction 3D et la quantification
- L'ensemble des projections angulaires acquises par l'OPT peut être reconstituée à l'aide du logiciel NRecon (SkyScan) pour créer une série de tranches de section transversale à travers l'analyse d'invasion. Ce logiciel est disponible au téléchargement gratuitement à http://www.skyscan.be/products/downloads.htm .
- Analyser les données reconstruites en utilisant le logiciel Volocity (PerkinElmer). Logiciel de démonstration gratuite est disponible pour téléchargement à http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/ .
- Afin de quantifier le volume épithéliales par coloration cytokératine, fixer un seuil minimum d'intensité de voxels pour réduire les interférences de la fluorescence de fond dans le canal cible. Nous avons défini ce seuil empiriquement à 9000 UA utilisant une liste de paramètres disponibles dans l'application de mesure, nous avons quantifié le volume de l'épithélium en continuité avec le noyau originel (délimitées dans le canal autofluorescente). Cela nous a permis de quantifier les volumes d'excroissance épithéliale entre les différents échantillons tumoraux.
6. Les résultats représentatifs:
Pendant le développement de l'analyse, un total de 52 cancers du sein biopsies avec une large gamme d'histopathologie ont été utilisés. Parmi ces <10% (5 / 52) a omis de fournir au moins un dosage d'invasion viable. L'échec de dosage a été due à des bactéries soit supra-infection ou d'insuffisance matérielle biopsie tumorale. Par conséquent l'application du test n'est pas limité à un sous-type spécifique de cancer du sein.
Dosages typiques (figure 1) fixée au bout de 20 jours en culture de collagène et ensuite colorées pour la cytokératine. Logiciels Volocity est capable de reconnaître à la fois la plus grande partie épithéliale continue avec le noyau originel et les groupes détachés d'envahir les cellules et quantifier chaque volume séparément.
Figure 1 Invasion des dosages. Après la fixation et à la quantification. Le test prend en charge les échantillons obtenus à partir de plusieurs sous-types de cancer du sein: a) ER + b) HER2 + et c) ER-.
Discussion
À base de collagène essais pour étudier le comportement des lignées cellulaires de cancer sont maintenant largement utilisés 6,7,8. Néanmoins, ces essais n'ont pas reflété pleinement la complexité de la tumeur et son environnement. Dans cette étude, nous montrons que du matériel humain cancer du sein peut être utilisé d'une manière semblable, ex vivo. Par ailleurs, l'OPT est un outil utile pour caractériser l'expansion 3D de cancer du sein. Nous avons constaté que la principale limitation de cette technique est la disponibilité du matériel tumoral (une seule biopsie est suffisant pour 4-6 dosages). Un autre facteur limitatif est que l'invasion de structure ne survient que dans environ 40% des essais. Pour surmonter cela, nous ajoutons régulièrement de tout traitement désiré journée autour de 7 à tous les tests avec une croissance visible.
L'utilisation de l'OPT pourrait être étendu à l'avenir également de détecter les changements en vrac, ex vivo, résultant d'un traitement médicamenteux. Ce pourrait à son tour de faciliter le traitement du cancer plus individualisée, indépendante des modèles animaux. Nous étudions actuellement la réponse des tumeurs ER + au tamoxifène ex vivo.
Disclosures
SEW et JF sont employés par MRC Technology, qui commercialise des scanners Bioptonics OPT. D'autres auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Lorna Renshaw (Breast Unit Edimbourg) pour son aide précieuse dans l'obtention des échantillons cliniques.
Utilisation de matériel tumoral a été approuvé par le comité éthique de la recherche Lothian (08/S1101/41) et obtenu sous les auspices du Centre de médecine expérimentale du cancer de programme (Edimbourg).
Ce travail est soutenu par le Conseil écossais de financement. ADL est une Mlle Margaret Butters Reekie confiance moniteur clinique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGM Complete | Lonza Inc. | CC-3150 | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8900 10X1L | |
| β-–stradiol | Sigma-Aldrich | E8875-250MG | |
| Rabbit anti-cytokeratin | Dako | Z0622 | |
| Goat anti-rabbit Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
| All other standard reagents were obtained from Sigma-Aldrich. | |||
References
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- Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited. J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).
- Dabrosin, C. Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle. J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).
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