Summary

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

Published: September 01, 2011
doi:

Summary

<em> In vivo</em> הדמיה פרוטוקול לפקח אקסונים חושית ראשוני הבאים למחוץ השורש הגבי מתואר. הנהלים לנצל רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו-thy1 YFP העכברים הטרנסגניים, ואת היתר הדמיה חוזרות ונשנות של התחדשות האקסון מעל 4 ס"מ ב PNS ואינטראקציות האקסון עם הממשק של מערכת העצבים המרכזית.

Abstract

אקסונים חושית העיקרי שנפגע פציעות שורש השדרה מצליחים להתחדש אל חוט השדרה, הגורם לכאב כרוני אובדן חושים קבע. התחדשות של הגב (DR) אקסונים שורש לתוך חוט השדרה הוא מנע בכניסה לאזור הגב שורש (דח), ממשק בין מערכת העצבים המרכזית ואת PNS. ההבנה שלנו את האירועים מולקולרית תאית למנוע התחדשות ב דח אינו שלם, בין השאר בשל שינויים מורכבים הקשורים פגיעה עצבית כבר להסיק ניתוחים שלאחר המוות. תהליכים תאיים דינמי, כגון התחדשות האקסון, נלמדים בצורה הטובה ביותר עם טכניקות ללכוד בזמן אמת אירועים עם תצפיות מרובות של כל חיה חיים. היכולת שלנו לפקח על נוירונים סדרתי in vivo גדל באופן דרמטי עקב חידושים מהפכניים באופטיקה ועכבר transgenics. כמה שורות של thy1-GFP העכברים הטרנסגניים, שבו תת נוירונים מסומנים בצבעי ניאון גנטית ברורה, היתר נוירונים בודדים להיות צילמו in vivo 1. עכברים אלו היו בשימוש נרחב בתחום ההדמיה vivo של השרירים והמוח 2-4 5-7, וגם סיפקו תובנות הרומן לתוך המנגנונים הפיזיולוגיים מנתח סטטי לא יכול להיות נפתרה. מחקרי הדמיה של נוירונים בחוט השדרה החיים החלו רק לאחרונה. ליכטמן ועמיתיו הראשון הפגינו ההיתכנות שלהם על ידי מעקב אחר נפצע הגבי (DC) אקסונים טור עם מיקרוסקופיה רחב בתחום 8,9. Multi-פוטון בתחום ההדמיה vivo של אקסונים ממוקם עמוק DC, microglia וכלי דם גם הושג 10. במהלך השנים האחרונות, יש לנו חלוץ ביישום בתחום ההדמיה vivo לפקח התחדשות של אקסונים DR שימוש רחב בתחום מיקרוסקופיה קו H של thy1-YFP עכברים. מחקרים אלו הובילו אותנו להשערה רומן על למה אקסונים DR מנועים התחדשות בתוך חוט השדרה 11.

בשורה של H-thy1 YFP עכברים, להבדיל YFP אקסונים + ממוקמים שטחית, אשר מאפשר אקסונים מספר לנטר בו זמנית. למדנו כי אקסונים DR להגיע דח הם צילמו המותני טוב יותר מאשר בחוט השדרה הצווארי. בדו"ח הנוכחי אנו מתארים מספר אסטרטגיות שמצאנו שימושי כדי להבטיח הדמיה לטווח ארוך וחזר מוצלח של אקסונים התחדשות DR. אלה כוללים שיטות לחסל אינטובציה חוזרים ונשנים הפרעה נשימתית, למזער ניתוח הקשורים מתח היווצרות צלקת, לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה ויציבה ללא phototoxicity.

Protocol

1. מיקרוסקופ להגדיר הכנה הדמיה ההדמיה שלנו להגדיר מורכב stereomicroscope לייקה MZ16 ניאון עם תריס מהיר מצלמה מקורר CCD נשלט על ידי תוכנה Metamorph. הכנת כרית חימום מבוקר תרמוסטטית ולהתאים את הפלט 32.5 ° C כדי ל…

Discussion

הדמיה DR התחדשות ישירות בעכברים החיים מאתגרת במיוחד, מכיוון שהיא דורשת laminectomy הגב כדי לפקח על צמיחה משמעותית האקסון פני שטח נרחב ואחריו מספר ניתוחים והוא הרדמה פולשנית הדמיה בפגישות הבאות. כמה אסטרטגיות סייעה להתגבר על אתגרים אלה. הדמיה ראשית, מוצלח נדרש צמצום תמותת ה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ד"ר אלן טסלר הערות ולעזור העריכה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NS062320.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 003782  
Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) 4811 8 mg/kg
Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) 2051 120 mg/kg
Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) 7571  
Small animal hair clippers Oster Professional, (McMinnville, TN) 76059-030  
Hair removal lotion Church & Dwight Co (Princeton, NJ) NAIR with Baby Oil  
Gauze sponges Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) 22-362-173  
Cotton-tipped swabs Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) 14-960-3Q  
1 mL syringes Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) 309602  
Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) 305115  
Spring scissors and forceps Fine Science Tools, (Foster City, CA)    
2.5-mm curved rongeurs Fine Science Tools, (Foster City, CA) 16221-14  
Lactated Ringer’s Injection USP B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) BBR-L7502  
Sterile saline solution APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) 918610  
Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) 62794-096-251  
Artificial dura Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) 1MVP40  
5-0 silk sutures Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) K-580  
Wound clips Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) A75  
Fluorescent stereomicroscope Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) MZ16  
CCD camera Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) ORCA-Rx2  
Temperature Controller World Precision Instruments (Sarasota, FL) ATC 1000  
Metamorph software Molecular Devices, (Sunnyvale, CA)    
Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA    

References

  1. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  2. Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
  3. Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
  4. Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
  5. Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  6. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
  7. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  8. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  9. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
  10. Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
  11. Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).

Play Video

Cite This Article
Skuba, A., Himes, B. T., Son, Y. Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy. J. Vis. Exp. (55), e3126, doi:10.3791/3126 (2011).

View Video