إنشاء ثنائي الأبعاد ركائز منقوشة على الحبس البروتين والخلايا
Summary
الذات تجميعها monolayers (صواريخ سام) التي تشكلت من سلسلة طويلة thiols ألكان على الذهب توفير ركائز محددة جيدا لتشكيل أنماط البروتين والحبس الخلية. الطباعة Microcontact من hexadecanethiol باستخدام (PDMS) ختم polydimethylsiloxane تليها الردم مع غليكول منتهية ألكان ثيول مونومر تنتج نمطا حيث البروتين وخلايا كثف فقط لمنطقة hexadecanethiol ختمها.
Abstract
الطباعة Microcontact يوفر السريع ، والأسلوب استنساخه للغاية لخلق نمط من ركائز محددة جيدا. 1 بينما يمكن استخدام الطباعة microcontact الطباعة مباشرة على عدد كبير من الجزيئات ، بما في ذلك البروتينات والحمض النووي 2 و 3 و silanes (4) وتشكيل الذات المجمعة monolayers (صواريخ سام) من سلسلة طويلة thiols ألكان على الذهب يوفر وسيلة بسيطة لحصر البروتينات والخلايا التي تحتوي على أنماط محددة لاصقة ومقاومة المناطق. ويمكن استخدام هذا الحبس الاحتياطي للسيطرة على مورفولوجيا الخلايا ومفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من الأسئلة في البروتين وبيولوجيا الخلية. هنا ، نحن تصف طريقة عامة لخلق أنماط البروتين واضحة المعالم للدراسات الخلوية 5 تنطوي هذه العملية على ثلاث خطوات : إنتاج رئيسية منقوشة به ضوئيه ، وخلق طابع PDMS ، وmicrocontact الطباعة من الذهب الركيزة المغلفة. منقوشة مرة واحدة ، وهذه ركائز ثقافة الخلية قادرة على حصر البروتينات و / أو الخلايا (الخلايا الأولية أو خطوط الخلية) لهذا النمط.
استخدام الكيمياء الذاتي أحادي الطبقة تجميع يسمح لمراقبة دقيقة فوق مناطق منقوشة لاصقة بروتين / خلية والمناطق غير لاصقة ، هذا لا يمكن تحقيقه باستخدام ختم المباشر البروتين. Hexadecanethiol ، وسلسلة طويلة ثيول ألكان المستخدمة في الطباعة microcontact الخطوة ، وتنتج سطح مسعور أن تمتز بسهولة البروتين من الحل. وجلايكول منتهية ثيول ، وتستخدم لردم المناطق غير المطبوعة من الركيزة ، ويخلق أحادي الطبقة التي هي مقاومة للامتصاص البروتين وبالتالي نمو الخلية. 6 تنتج هذه مونومرات ثيول monolayers منظم جدا أن تحدد بدقة مناطق الركيزة التي يمكن أن تدعم الامتزاز البروتين ونمو الخلية. ونتيجة لذلك ، وهذه الركائز هي مفيدة لطائفة واسعة من التطبيقات من دراسة السلوك بين الخلايا من 7 إلى خلق الالكترونيات الدقيقة 8
بينما تم استخدام أنواع أخرى من الكيمياء المونولاير للدراسات ثقافة الخلية ، بما في ذلك العمل من مجموعتنا trichlorosilanes به لخلق أنماط مباشرة على ركائز الزجاج ، 9 monolayers منقوشة تشكلت من thiols ألكان على الذهب هي على التوالي إلى الأمام للاستعداد. وعلاوة على ذلك ، وتستخدم لإعداد مونومرات المونولاير متاحة تجاريا ، ومستقرة ، ولا تتطلب معالجة أو تخزين تحت جو خامل. يمكن أن يعد من ركائز منقوشة thiols ألكان كما يمكن إعادة تدويرها وإعادة استخدامها مرات عدة ، والحفاظ على الحبس الخلية. 10
Protocol
Discussion
ويمكن لعدد من القضايا التي تنشأ في إنتاج معدني من أتقن استخدامها لخلق طابع PDMS. ناقص نتائج رقاقة مقاومة المغلفة في أنماط ضبابية وغير واضحة والتعرض المفرط لنتائج رقاقة مقاومة مغلف بالمطاط في ملامح الموسع أو مفقودة. بشكل عام ، والماجستير مع أحجام ميزة كبيرة (> 10 ميكرون)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف المجموعة بأكملها مورير في جامعة واشنطن التي جعلت المعرفة الجماعية هذا البروتوكول ممكن. يتم توفير التمويل اللازم لهذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة العقلية (1R01MH085495).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium pieces Kamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| DPBS | VWR | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
References
- Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication. Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).
- Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning. Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).
- Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. Microcontact printing of DNA molecules. Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).
- Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication. J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).
- Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).
- Prime, K. L., Whitesides, G. M. Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) – a model system using self-assembled monolayers. J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).
- Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration. Langmuir. , 17733-17738 (2010).
- Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).
- Yanker, D., Maurer, J. Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth. Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).
- Johnson, D., Maurer, J. Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture. Chemical Communications. , 520-522 (2011).
- Herne, T., Tarlov, M. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces. J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).
- Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon. J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).
- Johannes, M., Cole, D., Clark, R. Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography. Applied Physics Letters. , (2007).
- Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. Submerged microcontact printing (SμCP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps. Langmuir. , 12060-12063 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. , 2059-2067 (1997).
- Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing. Langmuir. , 5154-5158 (2005).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).
- Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. “Dip-pen” nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
- Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light. Langmuir. , 9080-9088 (2004).
