Den gyldne standard for DNA methylering analyse er genomiske sekventering af bisulfit konverteret DNA. Denne metode benytter sig af den øgede følsomhed cytosin sammenlignet med 5-methylcytosine (5-MEC) til bisulfit deaminering under sure betingelser. Unmethylated cytosines kan skelnes fra methyleres cytosines efter PCR-amplifikation af målet genomisk DNA.
Epigenetik beskriver arvelige ændringer i genfunktion, der opstår uafhængigt af DNA-sekvensen. Den molekylære basis af epigenetiske genregulering er kompleks, men det væsentlige indebærer ændringer i selve DNA eller proteiner med hvilke DNA associerede virksomheder. Den fremherskende epigenetiske ændringer af DNA i pattedyrs genomer er methylering af cytosin nukleotider (5-MEC). DNA methylering giver instruktion om at genekspression maskiner til hvor og hvornår genet skal udtrykkes. Den primære målsekvens for DNA-methylering hos pattedyr er 5'-CPG-3 'dinucleotides (figur 1). CPG dinucleotides er ikke jævnt fordelt over hele genomet, men er koncentreret i regioner af gentagne genomiske sekvenser og CPG "øer" ofte forbundet med genet initiativtagere (Figur 1). DNA methylering mønstre er etableret tidligt i udviklingen, moduleret under væv specifikke differentiering og forstyrret i mange sygdomstilstande, herunder kræft. For at understand den biologiske rolle af DNA methylering og dens rolle i sygdomme hos mennesker, præcise, effektive og reproducerbare metoder er nødvendige for at detektere og kvantificere de enkelte 5-MeCs.
Denne protokol for bisulfit konvertering er "gold standard" for DNA methylering analyse og letter identifikation og kvantificering af DNA methylering på enkelt nucleotid opløsning. Kemien i cytosin deaminering ved natriumbisulfit består af tre trin (Figur 2). (1) sulfonering: Tilføjelsen af bisulfit til de 5-6 dobbeltbinding af cytosin (2) Hydrolic deaminering: hydrolytisk deaminering af den resulterende cytosin-bisulfit derivat at give en uracil-bisulfit derivat (3) Alkali Desulphonation: Fjernelse af sulfonat gruppen af en alkalibehandling, at give uracil. Bisulfit fortrinsvis deaminates cytosin til uracil i enkelt-strenget DNA, mens 5-MEC, er refraktære over for bisulfit-medieret deaminering. Ved PCR-amplifikation, er uracil forstærkessom thymin, mens 5-MEC rester forblive som cytosines, så denatureret CpGs skal adskilles fra unmethylated CpGs ved tilstedeværelsen af et cytosin "C" versus thymin "T" restprodukt i løbet af sekventering.
DNA modifikation af bisulfit konvertering er en veletableret protokol, som kan udnyttes til mange metoder af DNA methylering analyse. Siden påvisning af 5-MEC ved bisulfit konvertering først blev påvist ved Frommer et al. 1 og Clark et al. 2, metoder baseret omkring bisulfit konvertering af genomisk DNA tegner sig for hovedparten af de nye data på DNA methylering. Forskellige metoder til post-PCR-analyse kan anvendes, afhængig af graden af specificitet og løsning af methylering påkrævet. Kloning og sekventering er stadig den mest tilgængelige metode, der kan give en enkelt nucleotid opløsning for metylering tværs af DNA-molekylet.
DNA methylering analyse af genom sekventering af bisulfit konverteret DNA er en veletableret og alsidig metode, der letter identifikation og kvantificering af DNA methylering på enkelt nucleotid opløsning. Men bisulfit konvertering og efterfølgende analyse bygger på den forudsætning, at dna er fuldt ombygget med hver unmethylated cytosin blive deamineret til uracil og kun methylerede cytosines resterende un-reaktive. Hvis konverteringen er ufuldstændig, kan der opstå problemer med analysen, da uomvendte unmethylated cytosines kan fejlagtigt tolkes som methylerede cytosines. Bisulfit konvertering kan optimeres på forskellige stadier for at maksimere andelen af konverteringen. For DNA til at være fuldt konverterede det først skal være enkelt strandede så cytosin rester er udsat for bisulfit ioner. Det første skridt, DNA denaturering, er kritisk og kan være kilde til ufuldstændig konvertering, hvis DNA ikke er fuldt denatureret. For at sikre,, at DNA er fuldt denatureret, er det vigtigt, at reaktionen parametre, herunder fjernelse af alle dermed forbundne protein, passende saltkoncentration, inkubationstemperatur og tid er egnede til at opretholde DNA i enkelt strandede kropsbygning. Det er vigtigt at bruge friske 3M NaOH og for at give en passende inkubationstid. Hvis DNA er modstand denaturering, kan nogle ændringer til protokollen, herunder udvidelse af inkubationstiden til 30 minutter eller fragmentering af DNA forud for denaturering lette DNA denaturering. Desuden kan en enkelt strandede DNA (ssDNA) re-anneal til dobbelt strandede DNA (dsDNA) under bisulfit konverteringen reaktion. Udførelse af reaktionen ved en højere temperatur (90-95 ° C) enten periodisk eller løbende under bisulfit reaktionen kan støtte vedligeholdelsen af ssDNA. Men det er vigtigt at være opmærksom på, at DNA-nedbrydning i høj grad er accelereret ved disse højere temperaturer. Forskellige reagenser kan også tilføjes at forstyrre re-udglødning af the DNA-strenge, såsom urinstof.
Koncentrationen af DNA og dets kvalitet kan også påvirke effektiviteten af bisulfit reaktion og ultimativ PCR udbytte. DNA-nedbrydning er en begrænsning af den bisulfit konverteringen protokollen. Den kemiske behandling af DNA introducerer forskellige Strand pauser i ssDNA og nogle af de barske vilkår nødvendigt for fuldstændig bisulfit konvertering herunder høj bisulfit koncentration, lange inkubationstider kan fremskynde DNA nedbrydning. Under standard reaktionen beskrevne betingelser, er DNA nedbrydning ikke er et fælles problem, men hvis protokol ændringer er indført, såsom for sekvenser, der er refraktære over for konvertering, for DNA-skabeloner, der nedbrydes eller af dårlig kvalitet, der FFPE prøver, så DNA-nedbrydning kan blive en væsentlig begrænsning.
Formalinfikserede, paraffinindstøbte embedded (FFPE) og nedbrudt DNA-prøver kan effektivt bisulfit konverteres og forstærkes ved hjælp af denne protokolMen ændringer for at sikre, at DNA ikke er yderligere nedbrydes tilrådes. Brugen af en transportør RNA såsom T RNA anbefales. Også glykogen kan tilføjes som en transportør, når DNA-koncentration er lav (<200 ng). Fordi DNA isoleret fra FFPE væv er allerede fragmenteret og yderligere opsplitning finder sted under deaminering, skal der drages omsorg for at minimere yderligere nedbrydning. Må ikke fragment DNA yderligere, før denaturering og begrænse inkubationstiden for bisulfit reaktion på 4 timer. Design amplikationsprodukter ikke større end 300 basispoint på grund af fragmenteret DNA.
En anden faktor, der kan påvirke PCR-amplifikation, at bisulfit konvertering af unmethylated cytosines reducerer kompleksiteten af DNA-skabelonen. Følgende primer design protokol skitseret i afsnit 4.1, øget primer længde og nested PCR kan alle bidrage til at øge specificiteten og PCR udbytte.
Endelig er da DNA-skabelonen ændres under bisulphITE konvertering, forstærkning skævhed kan være en bekymring. Sørg for, at proportional PCR-amplifikation af methylerede og unmethylated skabeloner er markeret med en kontrolgruppe 50/50 M / U DNA-mix, som skitseret i protokollen, jf. figur 3. Også sikre, at forstærkning af kun konverterede skabeloner, der sker ved hjælp af HpaIII restriktionsenzym og gelelektroforese (Figur 3). Den PCR-forhold kan være nødvendigt at optimeres ved at variere temperaturen og / eller magnesium koncentration eller forlængelse forlængelse tid. Nogle skabeloner synes at være særligt problematisk og primer position skal muligvis justeres eller degenerere primere kan have brug for at blive brugt.
Næste generation sekventering teknikker er i rivende udvikling for at opnå en lignende beslutning til bisulfit genomiske sekventering, og tredje generation enkelt molekyle sekventering har potentialet til at gøre det muligt for en analyse af både primære DNA og metylering uden behov for bisulfit sekvensering. Men, almindeligt tilgængelige og specificity af disse teknikker er fortsat et stykke tid væk. Bisulfit genomisk sekventering er den gyldne standard i methylering analyse og er en robust protokol. Metoden har udviklet sig til det punkt, hvor de fælles problemer og begrænsninger er blevet løst, og ansøgningerne har udvidet fra individuelle gen analyser til high throughput og hele genomet analyse beskrevet af Clark et al. 2006 4. Fejlfinding retningslinjer og yderligere anbefalinger er skitseret i tabel 1. Det foreslås, at den optimale tilgang er i første omgang at følge de standard-protokol, og kun indføre ændringer, hvis og når der opstår et problem.
Tabel 1. Fejlfinding Retningslinjer
The authors have nothing to disclose.