O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.
Epigenética descreve as mudanças hereditárias em função do gene, que ocorrem de forma independente para a seqüência de DNA. A base molecular da regulação do gene epigenético é complexa, mas essencialmente envolve modificações no próprio DNA ou as proteínas com as quais DNA associados. A modificação epigenética predominante de DNA em genomas de mamíferos é a metilação dos nucleotídeos citosina (5-MEC). Metilação do DNA fornece instruções para máquinas de expressão gênica de onde e quando o gene deve ser expresso. A seqüência alvo principal para a metilação do DNA em mamíferos é 5'-CpG-3 'dinucleotídeos (Figura 1). Dinucleotídeos CpG não são uniformemente distribuídos por todo o genoma, mas estão concentrados em regiões de seqüências genômicas repetitivos e CpG "ilhas" comumente associado com os promotores de gene (Figura 1). Padrões de metilação do DNA são estabelecidos no início do desenvolvimento, modulados durante a diferenciação de tecidos específicos e interrompida em muitos estados de doenças incluindo o câncer. Para understand o papel biológico de metilação do DNA e seu papel na doença humana, precisa, eficiente e reprodutível métodos são necessários para detectar e quantificar cada 5-MEC.
Este protocolo para a conversão de bissulfito é o "padrão ouro" para a análise de metilação do DNA e facilita a identificação e quantificação de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único. A química da desaminação de citosina por bissulfito de sódio envolve três etapas (Figura 2). (1) sulfonação: A adição de bissulfito à ligação 5-6 dobro de citosina Desaminação (2) hydrolic: desaminação hidrolítica do derivado resultante citosina-bissulfito de dar um derivado uracil bissulfito (3) Desulphonation Alkali: A remoção do sulfonato grupo por um tratamento alcalino, para dar uracil. Bissulfito preferencialmente deaminatos de citosina a uracil em DNA de fita simples, enquanto o 5-MEC, é refratária ao bissulfito mediada desaminação. Após a amplificação pela PCR, uracila é amplificadacomo timina enquanto 5-MEC resíduos permanecem como citosinas, permitindo CpGs metilado para ser distinguido de CpGs unmethylated pela presença de um "C" versus citosina timina "T" de resíduos durante o seqüenciamento.
DNA de modificação pela conversão de bissulfito é um protocolo bem estabelecido que pode ser explorado para muitos métodos de análise de metilação do DNA. Desde a detecção de 5-MEC pela conversão de bissulfito foi primeiramente demonstrada por Frommer et al. 1 e Clark et al. 2, os métodos baseados em torno de conversão de bissulfito de conta de DNA genômico para a maioria dos novos dados sobre a metilação do DNA. Diferentes métodos de análise pós PCR podem ser utilizados, dependendo do grau de especificidade e resolução de metilação necessário. Clonagem e sequenciamento é ainda o método mais prontamente disponíveis que podem dar resolução de nucleotídeo único para metilação do outro lado da molécula de DNA.
Análise de DNA por metilação do DNA sequenciamento genômico convertido bissulfito é um método bem estabelecido e versátil, que facilita a identificação e quantificação de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único. No entanto, a conversão de bissulfito e posterior análise baseia-se na premissa de que o DNA foi totalmente convertido com cada citosina unmethylated sendo desaminada de uracil e só citosinas metiladas restantes un-reativa. Se a conversão é incompleta, podem surgir problemas com a análise já que não convertida citosinas não metiladas podem ser incorretamente interpretado como citosinas metiladas. Conversão de bissulfito pode ser otimizado em vários estágios para maximizar a percentagem de conversão. Para o DNA para ser totalmente convertida em primeiro lugar deve ser fita simples de modo que os resíduos de citosina estão expostos aos íons bissulfito. O primeiro passo, desnaturação do DNA, é crítico e pode ser a fonte de conversão incompleta se o DNA não é totalmente desnaturado. Para garantirque o DNA é totalmente desnaturado, é importante que os parâmetros de reação, incluindo a remoção de todas as proteínas associadas, concentração de sal adequada, a temperatura de incubação e tempo são adequados para manter o DNA na conformação de fita simples. É importante usar fresco 3M NaOH e para dar tempo de incubação adequada. Se o DNA está resistindo desnaturação, algumas modificações no protocolo incluindo o alargamento do tempo de incubação a 30 minutos ou a fragmentação do DNA antes da desnaturação pode facilitar a desnaturação do DNA. Além disso, DNA de fita simples (ssDNA) pode re-anneal dobrar DNA de fita (dsDNA) durante a reação de conversão de bissulfito. Realizar a reação a uma temperatura superior (90-95 ° C) ou periodicamente, ou de forma contínua durante a reação de bissulfito pode ajudar a manutenção de ssDNA. No entanto, é importante estar ciente de que a degradação do DNA é muito acelerado a estas temperaturas mais elevadas. Vários reagentes também pode ser adicionado para interromper re-annealing of thfitas de DNA e, como a uréia.
A concentração de DNA e sua qualidade também pode afetar a eficiência da reação de bissulfito PCR e rendimento final. Degradação do DNA é uma limitação do protocolo de conversão de bissulfito. O tratamento químico do DNA introduz rupturas dos filamentos vários ssDNA e algumas das duras condições necessárias para a conversão de bissulfito completo, incluindo concentração de bissulfito de alta, os tempos de incubação longo podem acelerar a degradação do DNA. Nas condições de reação padrão descrito, a degradação do DNA não é um problema comum no entanto, se as modificações de protocolo são introduzidos, como por sequências que são refratários à conversão, para modelos de DNA que estão degradadas ou de baixa qualidade, tais como amostras de FFPE, em seguida, degradação do DNA pode se tornar uma limitação significativa.
Formalina parafina, fixo incorporado (FFPE) e amostras de DNA degradado pode ser efetivamente bissulfito convertido e amplificado utilizando este protocolo, No entanto modificações para garantir que o DNA não é mais degradadas são aconselhados. O uso de uma RNA transportador, tais como t RNA é recomendado. Glicogênio também pode ser adicionado como um transportador quando a concentração de DNA é baixa (<200 ng). Como o DNA isolado de tecidos FFPE já está fragmentado e fragmentação ocorre durante desaminação, os cuidados devem ser tomados para minimizar a degradação ainda mais. Não fragmento de DNA mais longe antes de desnaturação e limitar o tempo de incubação para a reação bissulfito a 4 horas. Design amplicons não maior do que 300 bp DNA devido a fragmentada.
Outro fator que pode afetar a amplificação por PCR que a conversão de bissulfito de citosinas não metiladas reduz a complexidade do modelo de DNA. O protocolo do projeto a seguir cartilha descritos na seção 4.1, o comprimento aumentou primário e PCR aninhado podem ajudar a aumentar a especificidade e rendimento de PCR.
Finalmente, uma vez que o modelo de DNA é alterada durante bisulphite de conversão, o viés de amplificação pode ser uma preocupação. Garantir que a amplificação PCR proporcional de modelos metilado e não metilado é verificada com um controle de mix 50/50 DNA M / U, conforme descrito no protocolo, veja a Figura 3. Também garantir que a amplificação de modelos apenas convertido está ocorrendo usando HpaIII enzima de restrição e eletroforese em gel (Figura 3). As condições de PCR podem precisar de ser otimizado através da variação da temperatura e concentração de / ou magnésio ou alongamento do tempo de extensão. Alguns modelos parecem ser particularmente problemática ea posição cartilha pode ter de ser ajustada ou iniciadores degenerados podem precisar de ser usado.
Técnicas de sequenciamento de última geração estão evoluindo rapidamente para conseguir uma resolução semelhante à de bissulfito de sequenciamento genômico, ea terceira geração de seqüenciamento única molécula tem potencial para permitir a análise de DNA de ambos primários e metilação sem a necessidade de seqüenciamento de bissulfito. No entanto, disponibilidade generalizada e especificaçõesificity destas técnicas permanecem algum tempo afastado. Sequenciamento genômico bissulfito é o padrão-ouro na análise de metilação e é um protocolo robusto. O método tem progredido ao ponto onde os problemas comuns e limitações foram resolvidas e as aplicações têm se expandido a partir de análises de genes individuais de alto rendimento e análise de genoma descrito por Clark et al. 2006 4. Diretrizes solução de problemas e recomendações adicionais estão descritos na Tabela 1. Sugere-se que a abordagem ideal é inicialmente seguir o protocolo padrão e apenas introduzir modificações se e quando surge um problema.
Tabela 1. Diretrizes Troubleshooting
The authors have nothing to disclose.