Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.
Epigenetik beschreibt die vererbbare Veränderungen in der Gen-Funktion, die unabhängig voneinander auftreten, um die DNA-Sequenz. Die molekulare Grundlage der epigenetischen Genregulation ist komplex, aber im Wesentlichen um Modifikationen an der DNA selbst oder die Proteine, mit denen DNA assoziiert. Der überwiegende epigenetische Veränderung der DNA in Säugetier-Genomen ist die Methylierung von Cytosin Nukleotide (5-MeC). DNA-Methylierung enthält Anweisungen, um die Genexpression Maschinen wie, wo und wann das Gen ausgedrückt werden sollte. Das primäre Ziel-Sequenz für die DNA-Methylierung in Säugetieren ist 5'-CpG-3 '-Dinukleotide (Abbildung 1). CpG-Dinukleotide sind nicht gleichmäßig über das Genom verteilt, sondern sind in Regionen repetitive genomische Sequenzen und CpG "Inseln" gewöhnlich mit Gen-Promotoren (Abbildung 1) assoziiert konzentriert. DNA-Methylierungsmuster sind früh in der Entwicklung, gegründet moduliert und im Gewebe spezifische Differenzierung gestört in vielen Erkrankungen wie Krebs. Um understand die biologische Rolle von DNA-Methylierung und deren Rolle in der menschlichen Krankheit, präzise, effiziente und reproduzierbare Methoden zur Erkennung und Quantifizierung von einzelnen 5-MECs.
Das Protokoll für die Bisulfit-Konvertierung ist der "Goldstandard" für die DNA-Methylierung und erleichtert die Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Methylierung bei single nucleotide Auflösung. Die Chemie der Cytosin-Desaminierung von Natriumbisulfit in drei Schritten (Abbildung 2). (1) Sulfonierung: Der Zusatz von Bisulfit an die 5-6 Doppelbindung von Cytosin (2) Hydrolic Desaminierung: hydrolytische Desaminierung der resultierenden Cytosin-Bisulfit-Derivat geben einen Uracil-Bisulfit-Derivat (3) Alkali Desulfonierung: Die Entfernung der Sulfonat Gruppe durch eine Alkalibehandlung zu Uracil. Bisulfit bevorzugt desaminiert Cytosin zu Uracil in Einzelstrang-DNA, während die 5-MeC ist refraktär gegenüber Bisulfit-vermittelte Desaminierung. Nach PCR-Amplifikation ist Uracil verstärktwie Thymin, während 5-MeC Rückstände als Cytosine bleiben, so dass methylierte CpG von methylierter CpG durch Vorhandensein eines Cytosin "C" versus Thymin "T"-Rest werden während der Sequenzierung aus.
DNA-Modifikation durch Bisulfit-Konvertierung ist ein gut etabliertes Protokoll, das für viele Methoden der DNA-Methylierung Analyse genutzt werden können. Da der Nachweis von 5-MeC von Bisulfit-Konvertierung wurde zuerst von Frommer et al. 1 und Clark et al. 2, Methoden um Bisulfit-Konvertierung von genomischen DNA-Konto für die Mehrheit der neuen Daten auf Basis von DNA-Beweis gestellt. Verschiedene Methoden der post-PCR-Analyse kann verwendet werden, je nach dem Grad der Spezifität und Auflösung der Methylierung erforderlich. Klonierung und Sequenzierung ist immer noch die am leichtesten zugängliche Methode, die single nucleotide Auflösung für Methylierung der gesamten DNA-Molekül geben kann.
DNA-Methylierung Analyse durch Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA ist ein gut etabliertes und vielseitige Methode, dass die Identifizierung und Quantifizierung von DNA-Methylierung bei single nucleotide Auflösung ermöglicht. Allerdings stützt sich Bisulfit Umwandlung und anschließende Analyse auf der Prämisse, dass die DNA wurde vollständig mit allen methylierten Cytosin wird in Uracil deaminiert und nur methylierte Cytosine verbleibenden un-reaktive umgewandelt. Wenn die Konvertierung nicht vollständig ist, können Probleme mit der Analyse ergeben sich da nicht umgesetzte unmethylierte Cytosine kann fälschlicherweise als methylierte Cytosine interpretiert werden. Bisulfit Umwandlung kann in verschiedenen Phasen optimiert werden, um den Prozentsatz der Umwandlung zu maximieren. Für die DNA vollständig umgestellt werden sie zuerst muss einzelsträngige, so dass Cytosinresten der Bisulfit-Ionen ausgesetzt sind. Der erste Schritt, DNA-Denaturierung, ist kritisch und kann die Quelle der unvollständigen Umwandlung werden, wenn die DNA nicht vollständig denaturiert. Um zu gewährleisten,dass die DNA vollständig denaturiert wird, ist es wichtig, dass die Reaktion Parameter einschließlich Entfernung aller assoziierten Protein, geeignete Salzkonzentration, Inkubationstemperatur und geeignet ist, um DNA in einzelsträngige Konformation zu halten sind. Es ist wichtig, an die frische 3M NaOH verwenden und für eine angemessene Inkubationszeit ermöglichen. Wenn die DNA widersteht Denaturierung, können einige Modifikationen, um das Protokoll einschließlich der Ausweitung des Inkubationszeit auf 30 Minuten oder Fragmentierung der DNA vor der Denaturierung zu erleichtern DNA-Denaturierung. Darüber hinaus können Einzelstrang-DNA (ssDNA) re-Glühen zu DNA (dsDNA) während der Bisulfit-Konvertierung Reaktion zu verdoppeln. Durchführung der Reaktion bei einer höheren Temperatur (90-95 ° C) entweder periodisch oder kontinuierlich während der Bisulfit-Reaktion kann Hilfe der Aufrechterhaltung der ssDNA. Es ist jedoch wichtig zu wissen, dass DNA-Abbau stark bei diesen höheren Temperaturen beschleunigt. Verschiedene Reagenzien können ebenfalls hinzugefügt, um re-Glühen von th stören werdene DNA-Stränge, wie Harnstoff.
Die Konzentration von DNA und deren Qualität kann auch Auswirkungen auf die Effizienz der Bisulfit-Reaktion und ultimative PCR-Ausbeute. DNA-Abbau ist eine Einschränkung der Bisulfit-Konvertierung Protokoll. Die chemische Behandlung der DNA werden verschiedene Brüche in ssDNA und einige der harten Bedingungen, die für komplette Bisulfit Konversion einschließlich High Bisulfit-Konzentration, lange Inkubationszeiten können DNA-Abbau zu beschleunigen. Unter dem Standard-Reaktionsbedingungen beschrieben, ist die DNA-Abbau nicht ein allgemeines Problem jedoch, wenn Protokoll Änderungen eingeführt werden, wie Sequenzen, die refraktär auf Umwandlung sind, für die DNA-Templates, die abgebaut oder von schlechter Qualität, wie FFPE Proben werden dann DNA-Abbau kann eine erhebliche Einschränkung geworden.
Formalin fixiert, in Paraffin eingebetteten (FFPE) und degradierte DNA-Proben werden effektiv umgewandelt und verstärkt Bisulfit mit diesem ProtokollAber Änderungen, um sicherzustellen, dass die DNA nicht weiter abgebaut werden empfohlen. Die Verwendung eines Trägers RNA, wie t-RNA wird empfohlen. Auch Glykogen als Träger hinzugefügt werden, wenn DNA-Konzentration ist gering (<200 ng). Da DNA aus FFPE Geweben isoliert ist bereits fragmentiert und weitere Fragmentierung erfolgt bei Desaminierung, muss darauf geachtet werden weitere Abbau zu minimieren. Nicht-Fragment DNA weiter vor Denaturierung und begrenzen die Inkubationszeit für die Bisulfit-Reaktion zu 4 Stunden. Design-Amplikons nicht größer als 300 bp durch fragmentierte DNA.
Ein weiterer Faktor, PCR-Amplifikation beeinflussen können, dass Bisulfit Umwandlung von nicht methylierten Cytosin die Komplexität der DNA-Vorlage reduziert. Die folgenden Primer-Design-Protokoll in Abschnitt 4.1, erhöhte Primer Länge und nested PCR beschrieben können alle dazu beitragen, Spezifität und PCR Ausbeute zu erhöhen.
Schließlich ist da die DNA-Vorlage in bisulph verändertite Wandlung, Verstärkung Bias kann ein Problem sein. Stellen Sie sicher, dass proportional PCR-Amplifikation von methylierter und nicht methylierter Vorlagen mit einer Kontrollgruppe 50/50 M / U DNA-Mix wird überprüft, wie im Protokoll beschrieben, siehe Abbildung 3. Stellen Sie außerdem sicher, dass Amplifikation nur umgewandelt Vorlagen auftritt mit HpaIII Restriktionsenzym und Gelelektrophorese (Abbildung 3). Die PCR-Bedingungen müssen möglicherweise durch Variation der Temperatur und / oder Magnesium-Konzentration oder Verlängerung Erweiterung optimiert werden. Einige Vorlagen werden als besonders problematisch und Primer-Position kann angepasst werden müssen oder degenerierte Primer können verwendet werden müssen.
Next Generation Sequencing-Techniken entwickeln sich rasant zu einer ähnlichen Auflösung zu erreichen, um genomische Sequenzierung Bisulfit und dritten Generation Einzelmolekül-Sequenzierung hat das Potenzial, für die Analyse von sowohl primärer DNA-Methylierung und ohne die Notwendigkeit für Bisulfit-Sequenzierung zu ermöglichen. Doch weit verbreitete Verfügbarkeit und specificity dieser Techniken noch einige Zeit weg. Bisulfit-Sequenzierung genomischer ist der Goldstandard in der Methylierungsanalyse und ist ein robustes Protokoll. Das Verfahren wurde bis zu dem Punkt, wo die gemeinsamen Probleme und Einschränkungen gelöst haben Fortschritte gemacht und die Anwendungen von einzelnen Gen-Analysen mit hohem Durchsatz und ganze Genom-Analyse von Clark et al erweitert. 2006 4. Troubleshooting-Richtlinien und weitere Empfehlungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Es wird vorgeschlagen, dass die optimale Vorgehensweise, zunächst folgen Sie den Standard-Protokoll und nur vorstellen Modifikation, ob und wann ein Problem auftaucht ist.
Tabelle 1. Richtlinien für die Problembehebung
The authors have nothing to disclose.