Il gold standard per l'analisi di metilazione del DNA è il sequenziamento del DNA genomico di bisolfito convertito. Questo metodo sfrutta l'accresciuta sensibilità della citosina rispetto ai 5-metilcitosina (5-MEC) di bisolfito deaminazione in condizioni acide. Cytosines non metilato può essere distinto dal cytosines metilato dopo amplificazione del DNA genomico di destinazione.
Epigenetica descrive le modifiche ereditabili nella funzione del gene che si verificano in modo indipendente per la sequenza del DNA. Le basi molecolari della regolazione genica epigenetica è complessa, ma riguarda essenzialmente modifiche alla stessa DNA o le proteine con che associa DNA. La modifica predominante epigenetici del DNA nei genomi dei mammiferi è metilazione di nucleotidi citosina (5-MEC). Metilazione del DNA fornisce istruzioni alle macchine di espressione genica da dove e quando il gene deve essere espresso. La sequenza target primario per la metilazione del DNA nei mammiferi è 5'-CpG-3 'dinucleotidi (Figura 1). Dinucleotidi CpG non sono distribuite uniformemente in tutto il genoma, ma sono concentrati nelle regioni di sequenze genomiche CpG ripetitivi e "isole", comunemente associato con i promotori dei geni (Figura 1). Metilazione del DNA sono nelle prime fasi di sviluppo, modulato durante la differenziazione dei tessuti specifici e interrotto in molti stati patologici tra cui il cancro. Per understand il ruolo biologico della metilazione del DNA e del suo ruolo nelle malattie umane, preciso, efficace e riproducibile i metodi sono necessari per rilevare e quantificare i singoli 5-MEC.
Questo protocollo per la conversione di bisolfito è il "gold standard" per l'analisi di metilazione del DNA e facilita l'identificazione e quantificazione di metilazione del DNA a singolo nucleotide risoluzione. La chimica della citosina deaminazione da bisolfito di sodio comporta tre fasi (Figura 2). (1) solfonazione: L'aggiunta di bisolfito al legame doppio 5-6 della citosina (2) Hydrolic deaminazione: deaminazione idrolitica del conseguente citosina-bisolfito derivati per dare un uracile-bisolfito derivati (3) Desulphonation Alcali: La rimozione del solfonato gruppo da un trattamento alcalino, per dare l'uracile. Bisolfito deamina preferenzialmente citosina a uracile nel DNA a singolo filamento, mentre la 5-MEC, è refrattario al bisolfito-mediata deaminazione. Su PCR, uracile è amplificatocome timina mentre 5-MEC residui permangono come cytosines, permettendo CpG metilati deve essere distinta da CpG non metilato dalla presenza di una "C" contro citosina timina residuo "T" durante la sequenza.
Modificazione del DNA mediante conversione bisolfito è una consolidata protocollo che può essere sfruttato per molti metodi di analisi di metilazione del DNA. Dal momento che la rilevazione di 5-MEC di conversione bisolfito per la prima volta dimostrato da Frommer et al. 1 e Clark et al. 2, basati su metodi di conversione bisolfito di conto DNA genomico per la maggior parte dei nuovi dati sulla metilazione del DNA. Diversi metodi di analisi post-PCR può essere utilizzata, a seconda del grado di specificità e risoluzione di metilazione richiesto. La clonazione e il sequenziamento è ancora il metodo più facilmente disponibile che può dare singolo nucleotide risoluzione per metilazione attraverso la molecola di DNA.
Metilazione del DNA mediante sequenziamento del DNA genomico di bisolfito convertito è un metodo ben definito e versatile che facilita l'identificazione e quantificazione di metilazione del DNA a singolo nucleotide risoluzione. Tuttavia, la conversione bisolfito e successiva analisi si basa sulla premessa che il DNA è stato completamente convertito, con ogni citosina non metilato essere deaminata a uracile e solo cytosines metilato rimanente non-reattivi. Se la conversione è incompleta, possono sorgere problemi con l'analisi in quanto non convertito cytosines non metilato può essere erroneamente interpretato come cytosines metilato. Bisolfito di conversione può essere ottimizzato in varie fasi di massimizzare la percentuale di conversione. Per DNA per essere pienamente convertito prima deve essere a singolo filamento in modo che i residui di citosina sono esposti agli ioni bisolfito. Il primo passo, denaturazione del DNA, è critica e può essere fonte di conversione incompleta se il DNA non è completamente denaturato. Per garantireche il DNA è completamente denaturato, è importante che i parametri di reazione compresi l'allontanamento di tutte le proteine associate, concentrazione salina del caso, temperatura di incubazione e il tempo sono adatti a mantenere il DNA a singolo filamento conformazione. E 'importante usare fresca NaOH 3M e per consentire un tempo adeguato di incubazione. Se il DNA sta resistendo denaturazione, alcune modifiche al protocollo compresi l'estensione del tempo di incubazione di 30 minuti o frammentazione del DNA prima di denaturazione può facilitare la denaturazione del DNA. Inoltre, DNA a singolo filamento (ssDNA), può ri-tempra di DNA a doppio filamento (dsDNA) durante la reazione di conversione bisolfito. Effettuare la reazione a una temperatura più alta (90-95 ° C) in modo periodico, o continuamente durante la reazione bisolfito può aiutare il mantenimento di ssDNA. Tuttavia, è importante essere consapevoli che la degradazione del DNA è notevolmente accelerato a queste temperature superiori. Reagenti diversi può anche essere aggiunto per interrompere la ricottura del secolofilamenti di DNA e, come l'urea.
La concentrazione del DNA e la sua qualità può colpire anche l'efficienza della reazione bisolfito ed ultima resa PCR. Degradazione del DNA è una limitazione del protocollo di conversione bisolfito. Il trattamento chimico del DNA presenta rotture di filamenti diversi ssDNA e alcune delle dure condizioni necessarie per la completa conversione bisolfito compresa la concentrazione bisolfito alta, lunghi tempi di incubazione possono accelerare la degradazione del DNA. Nelle condizioni di reazione standard descritto, la degradazione del DNA non è un problema comune però, se le modifiche del protocollo vengono introdotti, come per le sequenze che sono refrattari alla conversione, per i modelli di DNA che sono degradati o di scarsa qualità, come campioni FFPE, allora la degradazione del DNA può diventare una limitazione significativa.
Formalina fisso, paraffina (FFPE) e campioni di DNA degradato può essere efficacemente bisolfito convertita ed amplificata utilizzando questo protocolloTuttavia modifiche per garantire che il DNA non è ulteriormente degradata si consiglia. L'uso di un vettore RNA come t RNA è raccomandato. Anche glicogeno può essere aggiunto come un vettore quando la concentrazione di DNA è bassa (<200 ng). Perché il DNA isolato nei tessuti FFPE è già frammentata e ulteriore frammentazione avviene durante deaminazione, bisogna fare attenzione a ridurre al minimo un ulteriore degrado. Non frammenti di DNA ulteriormente prima di denaturazione e limitare il tempo di incubazione per la reazione bisolfito a 4 ore. Progettazione ampliconi non più grande di 300 bp a causa di DNA frammentato.
Un altro fattore che può influenzare l'amplificazione PCR che la conversione bisolfito di cytosines non metilato riduce la complessità del modello di DNA. Il seguente protocollo di progettazione fondo di cui al punto 4.1, lunghezza innesco aumentato e nested PCR possono contribuire ad aumentare la specificità e la resa della PCR.
Infine, poiché il modello del DNA è alterato durante bisulphite di conversione, il bias di amplificazione può essere una preoccupazione. Assicurarsi che l'amplificazione proporzionale PCR di modelli metilato e non metilato è verificata con un controllo 50/50 M / U mix di DNA, come indicato nel protocollo, si veda la Figura 3. Assicurarsi inoltre che l'amplificazione dei modelli convertiti solo si sta verificando con enzima di restrizione HpaIII e elettroforesi su gel (Figura 3). Le condizioni di PCR può avere bisogno di essere ottimizzato variando la concentrazione di temperatura e / o magnesio o allungando il tempo di estensione. Alcuni modelli sembrano essere particolarmente problematico e la posizione del primer può essere necessario regolare o degenerare primer può essere necessario utilizzare.
Prossima generazione di tecniche di sequenziamento sono in rapida evoluzione per ottenere una risoluzione simile a bisolfito di sequenziamento genomico, e la terza sequenza molecola singola generazione ha il potenziale per permettere l'analisi di entrambe le primarie e la metilazione del DNA senza la necessità di sequenziamento bisolfito. Tuttavia, ampia disponibilità e specificheificity di queste tecniche rimangono ancora molto tempo. Sequenziamento genomico bisolfito è il gold standard per l'analisi di metilazione ed è un protocollo robusto. Il metodo è progredita al punto in cui i problemi più comuni ed i limiti sono stati risolti e le applicazioni si sono ampliate dalle analisi di geni singoli throughput elevato e l'analisi dell'intero genoma descritta da Clark et al. 2006 4. Linee guida risoluzione dei problemi e ulteriori raccomandazioni sono riportate nella Tabella 1. Si suggerisce che l'approccio migliore è quello di seguire inizialmente il protocollo standard e solo introdurre la modifica se e quando sorge un problema.
Tabella 1. Linee Guida alla risoluzione dei problemi
The authors have nothing to disclose.