Summary
Voksen-født neuroner i de olfaktoriske pære kan optogenetically styres med Channelrhodopsin2-udtrykkende lentiviral injektion i rostralt vandrende åen og kroniske photostimulation med en implanteret miniature LED.
Abstract
Lokale interneuroner løbende regenereres i lugtekolben af voksne gnavere 1-3. I denne proces, der kaldes voksen neurogenese, neurale stamceller i væggene af lateral ventrikel give anledning til neuroblasts at migrere til flere millimeter langs rostralt vandrende stream (RMS) til at nå og indarbejde de olfaktoriske pære. For at studere de forskellige trin og virkningen af voksen-fødte neuron integration i allerede eksisterende olfaktoriske kredsløb, er det nødvendigt at selektivt mærke og manipulere aktiviteten af dette specifikke population af neuroner. Den seneste udvikling af optogenetic teknologier giver mulighed for at bruge lys til at netop aktivere denne særlige gruppe af neuroner, uden at påvirke omkringliggende neuroner 4,5. Her præsenterer vi en række procedurer for at viralt udtrykke Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP i en tidsmæssigt begrænset kohorte af neuroblasts i RMS, inden de når frem til lugtekolben og blive voksen-fødte neurons. Derudover viser vi, hvordan man implantat og kalibrere en miniature LED for kronisk in vivo stimulering af ChR2-udtrykkende neuroner.
Protocol
1. Stereotaxic injektioner
- Den virus, som benyttes i disse forsøg er en replikering-mangel lentiviral vektor baseret på hiv-virus til at udtrykke Channelrhodopsine2-YFP (gul fluorescerende protein) Fusion konstruere drevet af en synapsin promotor 6. Den plasmid blev gavmildt leveret af K. Deisseroth 's Research Group ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentiviruses kan fås fra kommercielle kilder eller fremstilles i laboratoriet i henhold til fastlagte protokoller 7. Gennemsnitlig vektor titer var i størrelsesordenen 10 10 transduktion enheder / ml. Viral delprøver opbevares ved -80 ° C og bør optøs lige før pipette læsning. Flere fryse / tø cykler bør undgås. Aldrig eksponering virus løsning direkte til tøris.
- Forbered glas pipetter hjælp borsilicatglas kapillærer på standard pipette aftrækker (Sutter P-97 Pipette aftrækker). Den trækker indstilling skal være korrekt kalibreret til at give en lang og stiv pipette. Dernæst skar spidsen af pipetten ved hjælp af en saks for at få en spids på 30-40 ìm i diameter. Store trak pipetter i en støvfri boks.
- Indstil Nanoject II microinjector med producentens anvisninger på levering af 50 NL. Forbered indsprøjtning pipetten ved back-påfyldning med mineralsk olie og sæt det ind på microinjector stemplet. Sæt microinjector på en stereotaxic ramme. Delvis tomme olie fra glaspipette før påfyldning med virus løsning
- Med en mikropipette, overførsel 2 μl af virus løsning på et sterilt stykke Parafilm. Sænk forsigtigt glaspipette i dråbe-virus løsning, og fylde pipetten med 1-2 μl. Sørg for, at der ikke er luftbobler i pipetten.
- Bedøver en mus med 100 mg / kg Ketamin og 10 mg / kg Xylazin, fortyndet i sterilt saltvand. Fjern hår fra hovedbunden afdyret ved hjælp af gnaver hårklippere, barberblade, sakse, eller kemisk depilitory agent. Desinficer hovedbunden med tre anvendelser af skiftevis 70% ethanol og betadine. Alle kirurgiske instrumenter bør også være autoklaveres og derefter desinficeres med 70% ethanol. Placer dyret i stereotaxic ramme med øre barer og næse bar, der sikrer at hovedet er sikker. Anvend øjet salve for at forhindre udtørring af hornhinder.
- Med en skalpel, skæres hovedbunden fra mellem øjnene til mellem ørerne. Træk skindet til side for at eksponere kraniet og forankre huden med et par klemmer. Rengør overfladen af kraniet. Den stereotaxic Apparatet nulstilles med spidsen af glasset pipetten på bregma. Så spidsen er placeret på injektionsstedet (Antero-posterior, 3,30; Medio-lateral, ± 0,82, til både højre og venstre hjernehalvdel, henholdsvis). Placeringen af næsen bar skal justeres i forhold til beregningen af stereotaxic koordinater. I vores eksperiment, er det næsen bar justeret until bregma og injektionsstedet er afstemt til den samme højde.
- Identificer injektionsstedet. Ved hjælp af en højhastigheds-kirurgisk boremaskine til at bore forsigtigt huller i kraniet. Med en bøjet kanylen hooked på spidsen, fjerne resterne af tynde ben at eksponere dura mater. Kontrollér, at hullet er centreret i den korrekte position. Pas på ikke at sprænges blodkar på overfladen af hjernen, mens boring. Hvis blodkarrene er bristet, tryk forsigtigt på overfladen af hjernen med en lille vatpind eller væv i flere sekunder, indtil blodtilførslen stopper.
- Sænk pipette og nul Dorso-ventrale højde, når spidsen af pipetten rører overfladen af hjernen. Derefter lavere til det korrekte Dorso-ventrale dybde (Dorso-bug, 2,9 fra hjernens overflade), og vent 30 sekunder for pres ligevægt. Injicér 4 gange 50 nl af virus for i alt 200 NL. Vent 30 sekunder mellem hver injektion.
- Et minut efter den sidste injektion, trække langsomt rørettte. Gentag punkt 1,6-1,8 for den anden halvkugle. Fjern dyret fra stereotaxic apparater, ren snittet og sy de afskårne huden ved hjælp af kirurgiske tråde. Lad dyret at inddrive på opvarmning pad før han vendte tilbage til buret. Derudover kan dyrene gives en ikke-steroide anti-inflammatoriske analgetikum (f.eks Carprofen 4mg/kg) umiddelbart efter og 3 dage efter operationen.
2. Kronisk LED implantation til in vivo optogenetic stimulation i lugtekolben
- Dyr injiceres med lentiviral partikler fører bilaterale næste kronisk implanteret med et miniature blå LED (Osram, LED CMS 4.6W blå). Lod LED-pins til en kvindelig miniature el-stik, så stikket er placeret på den modsatte side af LED. Kontroller at der ikke er elektrisk genvej og identificere de positive og negative pin på stikket. Afprøv LED ved at tilslutte den til en aktuel controller til LED selvom en ordentlig kabel.
- Til at måle og / eller sæt absolutte lys magt LED, montere LED på en mikromanipulator og position LED i direkte kontakt med fotodetektor af et power meter af et højdepunkt lysintensitet ved 470 nm. Bor et hul på 3 mm i diameter i en uigennemsigtig PVC bord. Anbringe denne pinhole til wattmeteret og opbygge en standardkurve af optiske effekt kontra input strøm til at beregne effekt pr mm 2.
- For at måle udbredelsen af lys gennem hjernen, udskårne blokke af frisk hjernevæv på 300, 500, 1000, 1500 og 2500 μm tykkelse på 0-4 ° C ACSF ved hjælp af en vibratome 14. Læg et stykke af kraniet med en kraniotomi identisk med den, der udføres i levende mus under LED. Først måler lyset magt uden væv centreret på LED. Derefter sted hver blok af væv mellem LED og fotodetektor af power meter, og måle strømmen. Byg en kurve af væv tykkelse kontra relative transmission fraktion, beregnet som forholdet mellemmellem den effekt, målt ved hjælp af væv og uden væv.
- Bedøver en mus med 100 mg / kg Ketamin og 10 mg / kg Xylazin, fortyndet i sterilt saltvand. Rengøre og desinficere LED med 70% ethanol. Fjern hår fra hovedbunden af dyret og desinficere hovedbunden med tre anvendelser af skiftevis 70% ethanol og betadine. Derefter placerer dyret i stereotaxic rammen. Anvend øjet salve for at forhindre udtørring af hornhinder. Sæt stikket til en stereotaxic indehaver. Placeringen af næsen baren bør justeres, indtil overfladen af kraniet over lugtekolben er helt vandret og parallel med overfladen af miniature LED.
- Med en skalpel, skæres hovedbunden fra 3 mm forreste til øjnene til 3 mm posteriort for ørerne. Træk skindet til side og forankre den med et par klemmer. Skrab væk membranerne på overfladen af kraniet ved hjælp af et barberblad. Rens og tør kraniet. Påfør et tyndt dække af cyanoacrylat lim til at tillade efterfølgende annoncehesion af dental akryl.
- I løbet af de olfaktoriske pærer, anvendelse af en high-speed kirurgisk boremaskine, en rektangulær kraniotomi (centreret på 5,1 mm caudale, 0 mm lateral fra bregma 1 mm caudale og 3 mm lateral) udføre. For at gøre dette, omhyggeligt tynde kraniet, indtil der kun et tyndt lag af knogler tilbage. Forsigtigt fjerne de resterende knoglen ved hjælp af en bøjet sprøjte nål. Særlig forsigtighed bør tages for at undgå punktering dura sagen, og brud de store blodkar, der ligger mellem de to hjernehalvdele, og i den caudale grænsen til olfaktoriske pærer. Blod akkumulation og koagulering på hjernens overflade udelukker optimal lysgennemtrængning i vævet. Skyl kraniotomi og overfladen af hjernen med sterilt saltvand og derefter tørre kraniet.
- Fastgør miniature LED til stikket. Sænk miniature LED på toppen af olfaktoriske pærer. De vigtigste akse miniature LED bør være parallel med rostralt-caudale akse af musen, Clean med sterilt saltvand og dRy kraniet. Fastgør derefter ført til, at kraniet med en første lag af akryl (dvs. polycarboxylate cement), efterfulgt af et andet lag af dental akryl. Tilføjelsen af to små skruer kan være nødvendigt at fastsætte LED. Skruerne skal indsættes på kraniet (posterior til LED position) og dækket med både akryl. Mens akryl stadig er flydende, trække sig tilbage og lim den frie kanter af hovedbunden på overfladen af dental akryl. Pas på ikke at anvende nogen akryl på stikket. Efter akryl er hærdet, skal du fjerne dyret fra stereotaxic apparater og lad det komme på en opvarmning pad før han vendte tilbage til buret. Dyr er efterladt isolerede i deres bur for at komme sig efter indgrebet i mindst syv dage. Derudover kan dyrene gives en ikke-steroide anti-inflammatoriske analgetikum (f.eks Carprofen 4mg/kg) umiddelbart efter og 3 dage efter operationen. Lysdioder bør testes før implantation og efter ophør af eksperimenter.
- Et lys elcal kabel bruges til at binde dyret til en aktuel controller til LED koblet til en puls generator (Master-8) til at styre tidspunktet og intensiteten af LED. Den tynde kabel giver mulighed for fuld bevægelsesfrihed. Vær omhyggelig med at respektere polariteten af stikket. Vende polaritet kan ødelægge LED.
3. Repræsentative resultater:
ChR2-YFP udtrykkes i transduced neuroner cirka 48 timer efter injektion, og forbliver stabilt i flere måneder 7. Figur 1 er et repræsentativt billede af en sagittal del af et paraformaldehyd-fikseret dyr 15 dage efter injektionen. Bemærk den tætte mærkning og størrelsen på injektionsstedet i RMS. Et stort antal af nyfødte celler har migreret langs RMS at kolonisere de forskellige lag af lugtekolben (fig. 1). Den fusion protein er udtrykt i alle neuron rum, herunder soma, dendritter, og pigge.
Miniature LED impla ntation giver mulighed for i stor skala og billig optisk stimulering af et bredt område af interesse. Dyret er bundet til LED controller med en let elektrisk kabel, der giver en komplet bevægelsesfrihed. Ved kendetegner lysdiffusion i hjernevævet og tærsklen for ChR2 aktivering, anslår vi, at optisk aktivering kan blive udløst i en dybde på ~ 2 mm under overfladen af LED (Fig. 2A). At overvåge den funktionelle aktivering af ChR2-udtrykkende neuroner in vivo, kan udtrykket af c-FOS, en markør for neuronal aktivitet, blive analyseret efter gentagne lys stimulation (Fig. 2B). Som et alternativ kan in vitro-elektrofysiologiske optagelser af ChR2-udtrykkende neuroner koblet til samlingspunkt lyspåvirkning skal udføres 14. Endelig har to-foton målrettet løs-patch optagelser blevet brugt til at studere den funktionelle aktivering af ChR2-udtrykkende kortikale neuroner af lignende miniature LED in vivo-9.
ntent ">
Figur 1. ChR2-YFP udtryk fra lentiviral injektion i rostralt vandrende åen. Repræsentant konfokal billeder af en saggital dele af lugtekolben af en mus 15 dage efter injektioner med en lentivirus i rostralt RMS. Bemærk tilstedeværelsen af spredte YFP nyfødte neuroner migrere fra slutningen af RMS til de forskellige lag af OB. De fleste af nyfødte celler (95%) er granula celler, som Soma ligger i Granulet cellelag (GCL) og dendritter arborize i den eksterne Plexiform Layer (EPL). En lille bestand af nyfødte neuroner trækker op til den mest overfladiske lag af OB, i den glomerulære Layer (GL). Skala bar, 100μm. Inset, høj forstørrelse af en nyfødt granula celle, viser membran udtryk for ChR2-YFP i dendritter såvel som i spines. Skala bar, 20μm.
Figur 2. Diagram over implanteret LED på toppen af olfaktoriske pære og lys-evoked c-FOS udtryk i ChR2-YFP udtrykke nye granula celler.
A, Skematisk tegning af den implanterede LED over olfaktoriske pærer.
B, repræsentant konfokal billeder, der viser dobbelt-mærkede ChR2-YFP + c-FOS + granula celler en time efter lyspåvirkning af de olfaktoriske pære. C-FOS udtryk er afsløret ved hjælp af en kanin anti-c-FOS primære antistof (Calbiochem, 1:5000) og A568-konjugeret anti-kanin sekundært antistof (Invitrogen, 1:1000). Skala bar, 10μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetic værktøjer har for nylig øget vores kontrol over selektiv neuronal befolkninger, herunder voksne født neuroner i de olfaktoriske system. Her beskriver vi, hvordan du udfører en stereotaxic injektion af en lentiviral vektor udtrykke ChR2-YFP i en bestemt population af voksne født neuroner. Ved nøje at overvåge den periode efter injektion, er vi i stand til at analysere og manipulere aktiviteten af en kohorte af voksen-født neuroner med en relativ homogen alder.
På grund af deres lave diffusion spredning, deres høje transduktion effektivitet og deres relative gode tropisme for neuroblasts af RMS, skal lentiviral vektorer blive favoriseret i forhold til andre virale vektorer, såsom retrovirus eller adeno-associeret virus (AAV). Fordi de selektivt inficere celledeling, såsom stamceller eller stamceller, skal retrovirus vektorer injiceres i subventricular zone og transduce en mindre bestand af nyfødte neuroner. Sammenlignet med lentiviral vectors, AAV vektorer giver en langt større spredning af infektionen. Imidlertid bør AAV transduktion af neuroblasts i RMS undgås på grund af transduktion af omkringliggende strukturer såsom tilbehøret olfaktoriske kerne, en region, at projekter axoner tilbage i lugtekolben. Endelig, brug af implanterede lysdioder kan anvendes på andre overfladiske strukturer i hjernen som f.eks kortikale områder, hvor ChR2 udtryk drives i specifikke populationer af neuroner gennem virale vektorer eller via en af transgene mus linje 10.
Med LED-implantation, er vi i stand til at anvende kroniske optisk stimulering for at studere den funktionelle rolle lugtekolben voksne neurogenese i vågen opfører dyr. Denne enkle lyskilde giver en hurtig tidsmæssig styring af lys takket være den iboende hurtige tænd / sluk-hastighed på lysdioder. Ud over at være billig, producerer et miniature LED-lyskilde tilstrækkelig strøm (~ 100mW) for ChR2 aktivering i et stort volumen af hjernenvæv 11, selv bilateralt i tilfælde af olfaktoriske pærer. Dette er særligt vigtigt i dette område af hjernen, hvor betydelige læsioner kan være uden effekt på lugt-kvalitet opfattelse på grund af en høj grad af redundans i input fra de lugtepithelet 12. Takket være dets magt og dets spektrale båndbredde (25nm), kan disse miniature lysdioder bruges til light-evoked excitation hjælp ChR2 samt andre udgaver af channelrhodopsins såsom Cheta eller fange. Miniature gul (597nm) og rød (624 eller 637nm) lysdioder er til rådighed skal bruges til rød-forskudt rhodopsins såsom halorhodopsin og VChR1 13.
Miniature Lysdioder viser også begrænsninger. For at undgå opvarmning af hjernen, skal et kompromis findes mellem impulsvarighed, pulsfrekvens, og lysintensitet. For eksempel er korte lysimpulser af 5 millisekunder anbefales ved høje frekvenser (> 20 Hz) og lysintensitet på 100 mW. Over denne varighed, væsentligt bedre enmyre elevation af temperaturen (~ 1-4 ° C) i det omgivende væv kan måles. Denne parameter skal tages hensyn til længere lysimpulser (> 5ms) eller kontinuerlig lys stimulation, navnlig i tilfælde af lys-evoked hyperpolarisering hjælp halorhodopsin. Desuden giver den nuværende forsyning LED stærke elektriske artefakt, der kan udelukke en in vivo elektrofysiologiske optagelser, når LED er i direkte kontakt med vævet. Laser-koblede optiske fibre udgør et muligt alternativ, så en mindre og mere begrænset optisk stimulation. Dog kan den manglende fleksibilitet i optiske fibre forstyrre visse adfærd.
Efter karakterisering af dette lysgennemtrængning og funktionelle stimulering af neuroner af lys, kan in vivo optisk stimulering blive udløst i kombination med adfærdsmæssige eksperimenter. Særlig forsigtighed bør tages hensyn til timingen af stimulation. Synkronisering af photostimuning med en bestemt adfærd eller opgave i et adfærdsmæssige apparat, især under operant betingning, kan være afgørende for at etablere en årsagssammenhæng mellem celle aktivering og adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af livsforsikringsselskabet "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurovidenskaber de Paris (ENP), Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" inden for rammerne af "ERA-NET NEURON" af 7. rammeprogram, som Europa-Kommissionen, "Foundation pour la Recherche Medicale", den Letten Foundation og Pasteur Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
