Summary
Neurones adultes-né du bulbe olfactif peut être contrôlé à l'aide optogenetically Channelrhodopsin2 exprimant l'injection lentiviral dans le flux migratoire et rostrale photostimulation chronique avec une miniature implanté à LED.
Abstract
Interneurones locaux sont continuellement régénéré dans le bulbe olfactif des rongeurs adultes 1-3. Dans ce processus, appelé neurogenèse adulte, les cellules souches neurales dans les murs du ventricule latéral donner lieu à des neuroblastes qui migrent pour plusieurs millimètres le long du ruisseau rostrale migrateurs (RMS) à atteindre et à intégrer dans le bulbe olfactif. Pour étudier les différentes étapes et l'impact de l'intégration des neurones adultes nés dans les circuits préexistants olfactif, il est nécessaire de manière sélective l'étiquette et de manipuler l'activité de cette population spécifique de neurones. Le développement récent des technologies de l'optogénétique offre la possibilité d'utiliser la lumière pour activer précisément cette cohorte spécifique de neurones sans affecter les neurones entourant 4,5. Ici, nous présentons une série de procédures visant à exprimer de manière virale Channelrhodopsin2 (CHR2)-YFP dans une cohorte temporellement limitée des neuroblastes dans le RMS avant qu'ils atteignent le bulbe olfactif et devenir adulte-né neurons. De plus, nous montrons comment l'implant et calibrer une miniature à LED pour les maladies chroniques dans la stimulation in vivo de neurones exprimant CHR2-.
Protocol
1. Stéréotaxique injections
- Le virus utilisé dans ces expériences est un vecteur lentiviral réplication déficiente basée sur le virus du VIH à exprimer Channelrhodopsine2-YFP (Yellow Fluorescent Protein) construction de fusion piloté par un promoteur synapsine 6. Le plasmide a été généreusement fourni par K. Deisseroth «groupe de recherche ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Les lentivirus peuvent être obtenus auprès de sources commerciales ou produites dans le laboratoire selon des protocoles établis 7. Les titres ont été vecteur moyen de l'ordre de 10 10 unités de transduction / ml. Aliquotes virale sont stockés à -80 ° C et doivent être décongelés juste avant le chargement de la pipette. Plusieurs cycles gel / dégel doivent être évités. Jamais l'exposition de la solution de virus directement à la glace sèche.
- Préparer les pipettes en verre à l'aide de verre borosilicate capillaires sur le standard pipette extracteur (Sutter P-97 Pipette extracteur). Le réglage en tirant doit être correctement étalonnés pour donner une pipette de long et rigide. Ensuite, coupez l'extrémité de la pipette à l'aide d'une paire de ciseaux pour obtenir un pourboire de 30 à 40 um de diamètre. Boutique tiré des pipettes dans une boîte sans poussière.
- Configuration du Nanoject II microinjecteur aux instructions du fabricant pour la livraison de 50 nL. Préparer la pipette d'injection par l'arrière-remplissage avec de l'huile minérale et l'insérer dans le plongeur microinjecteur. Fixez le microinjecteur sur un cadre stéréotaxique. L'huile partiellement vides de la pipette en verre avant de le remplir avec la solution de virus
- Avec une micropipette, transfert de 2 pi de solution de virus sur un morceau de parafilm stérile. Abaissez délicatement la pipette en verre dans la goutte de solution de virus et de remplir la pipette avec 1-2 pi. Assurez-vous qu'il n'y ait pas de bulles d'air dans la pipette.
- Anesthetize une souris avec 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine, dilué dans une solution saline stérile. Retirez les cheveux du cuir chevelu de l'animaux en utilisant des rongeurs tondeuses, rasoirs, ciseaux, ou de l'agent depilitory chimiques. Désinfecter le cuir chevelu avec trois applications de l'alternance 70% d'éthanol et de la bétadine. Tous les instruments chirurgicaux doivent également être autoclavé puis désinfectée avec de l'éthanol à 70%. Placez l'animal dans le cadre stéréotaxique avec des barres d'oreilles et d'un bar nez, assurant que la tête est sécurisé. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée.
- Avec un scalpel, découper le cuir chevelu d'entre les yeux entre les oreilles. Tirez la peau de côté pour exposer le crâne et la peau d'ancrage avec une paire de pinces. Nettoyer la surface du crâne. L'appareil stéréotaxique est remis à zéro avec la pointe de la pipette en verre au bregma. Puis la pointe est positionnée au site d'injection (antéro-postérieur, 3,30; médio-latérale, ± 0,82, pour les deux hémisphères droit et gauche, respectivement). La position de la barre de nez doit être ajustée selon le calcul des coordonnées stéréotaxiques. Dans notre expérience, la barre de nez est ajustée uusqu'à bregma et le site d'injection sont alignés à la même hauteur.
- Identifier le site d'injection. Utiliser une perceuse haute vitesse chirurgicaux, soin de percer des trous dans le crâne. Avec une aiguille de seringue plié accroché à la pointe, retirez les restes d'os minces pour exposer la dure-mère. Vérifiez que le trou est centré à la position correcte. Prenez soin de ne pas rompre les vaisseaux sanguins sur la surface du cerveau pendant le forage. Si les vaisseaux sanguins se rompent, appuyez doucement sur la surface du cerveau avec un coton-tige ou un tissu de petites pendant plusieurs secondes jusqu'à ce flux de sang s'arrête.
- Basse de la pipette et le zéro de la hauteur dorso-ventrale lorsque l'extrémité de la pipette touche la surface du cerveau. Puis, inférieure à la profondeur correcte dorso-ventrale (dorso-ventral, 2,9 de la surface du cerveau) et attendre 30 secondes pour que l'équilibre de pression. Injecter 4 fois 50 nl de virus pour un total de 200 nl. Attendre 30 secondes entre chaque injection.
- Une minute après la dernière injection, retirer lentement le tuyauTTE. Répétez les points 01.06 à 01.08 pour l'autre hémisphère. Retirer l'animal de appareil stéréotaxique, nettoyer l'incision et coudre la peau coupés à l'aide fils chirurgicaux. Permettre à l'animal de retrouver sur le pavé réchauffement avant de revenir à la cage. En outre, les animaux peuvent être donnés un non-stéroïdiens anti-inflammatoires analgésiques (par exemple, carprofène 4mg/kg) immédiatement après et 3 jours après la chirurgie.
2. Chronique d'implantation de LED pour la stimulation optogénétique vivo dans le bulbe olfactif
- Animaux injectés avec des particules lentiviraux bilatérale sont la prochaine chronique implantés avec une LED bleue en miniature (Osram, LED CMS 4,6 W en bleu). Soudez les broches de LED à un connecteur électrique femelle miniature, de sorte que le connecteur est placé sur le côté opposé de la LED. Vérifiez qu'il n'y ait pas coupé court-circuit et d'identifier les pôles positifs et négatifs sur le connecteur. Test de la LED en le connectant à un régulateur de courant pour les LED si un câble adéquat.
- Pour mesurer et / ou définir la puissance lumineuse de la LED absolue, montez la LED sur un micromanipulateur et la position de la LED en contact direct avec le photodétecteur d'un mesureur de puissance d'une intensité lumineuse maximale à 470 nm. Percez un trou d'épingle de 3 mm de diamètre dans un conseil en PVC opaque. Apposez ce trou d'épingle pour le wattmètre et de construire une courbe standard de puissance optique par rapport courant d'entrée pour calculer la puissance par mm 2.
- Pour mesurer la propagation de la lumière à travers le cerveau, couper des blocs de tissu cérébral frais de 300, 500, 1000, 1500 et 2500 micron d'épaisseur de 0-4 ° C en utilisant un ACSF 14 vibratome. Placez un morceau de crâne avec une craniotomie identique à celle réalisée chez la souris vivent sous la LED. Tout d'abord, de mesurer la puissance lumineuse sans tissu centrée sur le DEL. Ensuite, placez chaque bloc de tissu entre le LED et le photodétecteur du compteur d'électricité, et de mesurer la puissance. Construire une courbe de l'épaisseur du tissu par rapport fraction de transmission relative, calculée comme le rapportentre la puissance mesurée à travers les tissus et sans tissus.
- Anesthetize une souris avec 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine, dilué dans une solution saline stérile. Nettoyez et désinfectez la LED avec 70% d'éthanol. Retirez les cheveux du cuir chevelu de l'animal et de désinfecter le cuir chevelu avec trois applications de l'alternance 70% d'éthanol et de la bétadine. Ensuite, placez l'animal dans le cadre stéréotaxique. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée. Fixez le connecteur à un titulaire de stéréotaxie. La position de la barre de nez doit être ajusté jusqu'à ce que la surface du crâne au-dessus du bulbe olfactif est parfaitement horizontal et parallèle à la surface de la miniature à LED.
- Avec un scalpel, découper le cuir chevelu à partir de 3 mm en avant pour les yeux à 3 mm en arrière des oreilles. Tirez la peau de côté et de l'ancrer avec une paire de pinces. Grattez les membranes à la surface du crâne à l'aide d'une lame de rasoir. Nettoyez et séchez le crâne. Appliquez une mince couverture de colle cyanoacrylate pour permettre ad ultérieurescohésion de l'acrylique dentaire.
- Utiliser une perceuse haute vitesse chirurgicale, effectuer une craniotomie rectangulaires (1 mm et 3 mm caudale latérale; centrée sur 5,1 mm caudale, 0 mm latéral du bregma) au cours des bulbes olfactifs. Pour ce faire, soigneusement fine du crâne jusqu'à ce qu'une fine couche de restes osseux. Retirer délicatement l'os restant avec l'aide d'une aiguille de seringue plié. Des précautions particulières doivent être prises pour éviter la perforation de la dure-mère et de la rupture des vaisseaux sanguins principaux qui se situent entre les deux hémisphères et dans le bord caudal du bulbe olfactif. L'accumulation de sang et de coagulation à la surface du cerveau empêche la pénétration optimale de la lumière dans le tissu. Rincer la craniotomie et la surface du cerveau avec une solution saline stérile et sécher ensuite le crâne.
- Fixez la miniature à LED sur le connecteur. Abaissez la miniature à LED sur le dessus des bulbes olfactifs. L'axe principal de la miniature à LED doit être parallèle à l'axe rostrale-caudale de la souris, nettoyer avec une solution saline stérile et dry le crâne. Fixez ensuite la LED sur le crâne avec une première couche d'acrylique (c'est à dire, le ciment polycarboxylate), suivie par une deuxième couche d'acrylique dentaire. L'ajout de deux petites vis peut être nécessaire de fixer la LED. Les vis doivent être insérés sur le crâne (postérieure à la position LED) et couvert à la fois avec l'acrylique. Alors que l'acrylique est encore liquide, replier et coller les bords libres du cuir chevelu sur la surface de l'acrylique dentaire. Prenez soin de ne pas appliquer l'acrylique sur le connecteur. Après l'acrylique a durci, enlever l'animal de appareil stéréotaxique et le laisser récupérer sur un pad réchauffement avant de revenir à la cage. Les animaux sont laissés isolés dans leur cage pour récupérer de la chirurgie pour au moins sept jours. En outre, les animaux peuvent être donnés un non-stéroïdiens anti-inflammatoires analgésiques (par exemple, carprofène 4mg/kg) immédiatement après et 3 jours après la chirurgie. LED doit être testé avant l'implantation et après la fin des expériences.
- Une lumière éleccal câble est utilisé pour attacher l'animal à un régulateur de courant pour LED couplée à un générateur d'impulsions (Master-8) pour contrôler le moment et l'intensité de la LED. Le câble mince permet une totale liberté de mouvement. Prenez soin de respecter la polarité du connecteur. Inversion de la polarité peut casser la LED.
3. Les résultats représentatifs:
CHR2-YFP est exprimée dans les neurones transduites environ 48 heures après l'injection, et reste stable pendant plusieurs mois 7. La figure 1 est une image représentative d'une coupe sagittale d'un animal de paraformaldéhyde-fixe de 15 jours après l'injection. Notez l'étiquetage dense et la taille du site d'injection dans le RMS. Un grand nombre de cellules-nés ont migré le long de la RMS pour coloniser les différentes couches du bulbe olfactif (fig. 1). La protéine de fusion est exprimée dans tous les compartiments de neurones, dont le soma, les dendrites et des épines.
Miniature à LED impla ntation permet à grande échelle et peu coûteux stimulation optique d'une vaste région d'intérêt. L'animal est attaché au contrôleur LED avec un câble de lumière électrique qui permet une totale liberté de mouvement. En caractérisant la diffusion de la lumière dans le tissu cérébral et le seuil d'activation CHR2, nous estimons que l'activation optique pourrait être déclenchée à une profondeur de ~ 2mm en dessous de la surface de la diode (figure 2A). Pour surveiller l'activation fonctionnelle de CHR2-neurones exprimant in vivo, l'expression de c-fos, un marqueur de l'activité neuronale, peuvent être analysées après stimulation lumineuse répétitives (figure 2B). Comme alternative, dans les enregistrements électrophysiologiques in vitro des neurones exprimant CHR2-couplée à une stimulation lumineuse focale peut être effectuée 14. Enfin, à deux photons ciblées lâche-patch enregistrements ont été utilisés pour étudier l'activation fonctionnelle de CHR2-exprimant les neurones corticaux par des miniatures semblables LED in vivo 9.
ntent ">
Figure 1. CHR2-YFP l'expression de l'injection lentiviral dans le flux migratoire rostrale. Représentant images confocale d'une des sections sagittales du bulbe olfactif de souris 15 jours après les injections d'un lentivirus dans la rostrale RMS. Notez la présence de nouveaux neurones dispersés YFP migration depuis la fin de la RMS pour les différentes couches de l'OB. La plupart des cellules-nés (95%) sont des cellules granulaires, qui se trouvent soma dans la couche de cellules granulaires (GCL) et des dendrites s'arborisent dans la couche externe plexiformes (EPL). Une petite population de nouveaux neurones migrent jusqu'à la couche la plus superficielle de l'OB, dans la couche glomérulaire (GL). La barre d'échelle, 100 microns. En médaillon, fort grossissement d'une cellule de granules nouveau-né, montrant l'expression membranaire de CHR2-YFP dans les dendrites ainsi que dans les épines. La barre d'échelle, 20μm.
Figure 2. Schéma d'implantation LED sur le dessus du bulbe olfactif et de lumière évoque l'expression de c-fos dans CHR2-YFP cellules exprimant des granules de nouvelles.
A, Schéma de la LED implanté au-dessus des bulbes olfactifs.
B, représentant des images montrant confocale doublement marquée CHR2-YFP + c-fos cellules granulaires + une heure après la stimulation lumineuse du bulbe olfactif. C-fos expression est révélé en utilisant un anticorps de lapin anti-c-fos anticorps primaire (Calbiochem, 1:5000) et A568-anti-lapin conjugué anticorps secondaire (Invitrogen, 1:1000). La barre d'échelle, 10 microns.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Des outils optogénétique ont récemment augmenté notre contrôle sur sélective populations neuronales, y compris les adultes neurones né dans le système olfactif. Nous décrivons ici comment effectuer une injection stéréotaxique d'un vecteur lentiviral exprimant CHR2-YFP dans une population spécifique de neurones adultes-né. En surveillant la période post-injection, nous sommes capables d'analyser et de manipuler l'activité d'une cohorte d'adultes-né des neurones avec un âge relatif homogène.
En raison de leur propagation faible diffusion, leur efficacité de transduction élevées et leur tropisme pour les neuroblastes relative bonne de la RMS, vecteurs lentiviraux devraient être favorisés par rapport aux autres vecteurs viraux tels que les rétrovirus ou les virus adéno-associés (AAV). Parce qu'ils infectant sélectivement les cellules se divisent, comme les cellules souches ou progénitrices, vecteurs rétroviraux doivent être injectés dans la zone sous-ventriculaire et de transduire une plus petite population de neurones nés. Comparé à lentiviraux vecteurs, vecteurs AAV offrir une répartition beaucoup plus élevé d'infection. Toutefois, la transduction AAV des neuroblastes dans le RMS doit être évitée en raison de la transduction des structures environnantes telles que le noyau olfactif accessoire, une région que les projets axones de nouveau dans le bulbe olfactif. Enfin, l'utilisation de diodes implantées peuvent être appliqués à d'autres structures superficielles du cerveau telles que les régions corticales dans lesquelles l'expression CHR2 est entraîné dans des populations spécifiques de neurones par des vecteurs viraux ou via une lignée de souris transgéniques 10.
Avec l'implantation de LED, nous sommes en mesure d'appliquer une stimulation chronique optique pour étudier le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte ampoule olfactive dans éveillés animaux au comportement. Cette source de lumière simple permet un contrôle rapide temporelle de lumière grâce à la rapidité intrinsèque on / off la vitesse de LED. En plus d'être peu coûteux, une source de lumière LED miniatures produit suffisamment de puissance (100mW ~) pour CHR2 activation dans un grand volume du cerveautissus 11, même de façon bilatérale dans le cas des bulbes olfactifs. Ceci est particulièrement important dans cette région du cerveau où les lésions significatives peuvent être sans effet sur la perception de la qualité d'odeur due à un degré élevé de redondance dans les entrées de l'épithélium olfactif 12. Merci à sa puissance et sa largeur de bande spectrale (25nm), ces LED miniatures peuvent être utilisés pour la lumière d'excitation utilisant CHR2 évoqué ainsi que les autres versions du channelrhodopsins tels que Cheta ou Catch. Miniature jaune (597nm) et rouge (624 ou 637nm) LED sont disponibles pour être utilisés pour décalée vers le rouge rhodopsins tels que halorhodopsin et VChR1 13.
LED miniatures montrent aussi les limites. Pour éviter un échauffement du cerveau, un compromis doit être trouvé entre la durée d'impulsion, fréquence des impulsions, et l'intensité lumineuse. Par exemple, des impulsions de lumière courtes de 5 millisecondes sont recommandés à des fréquences élevées (> 20 Hz) et l'intensité lumineuse de 100 mW. Au-dessus de cette durée, une significl'élévation de la température de fourmi (~ 1-4 ° C) dans les tissus environnants peuvent être mesurés. Ce paramètre doit être pris en compte pour plus des impulsions de lumière (> 5 ms) ou la stimulation lumineuse continue, notamment dans le cas de la lumière évoquée hyperpolarisation utilisant halorhodopsin. En outre, le courant alimentant la LED fournit une forte artefact électrique, ce qui peut empêcher in vivo des enregistrements électrophysiologiques lorsque la LED est en contact direct avec le tissu. Laser couplé fibres optiques constituent une alternative possible, permettant une stimulation plus petits et plus restreint d'optique. Cependant, la rigidité des fibres optiques peuvent interférer avec certains comportements.
Après la caractérisation de la pénétration de lumière et la stimulation des neurones fonctionnels par la lumière, dans la stimulation optique in vivo peut être déclenchée en combinaison avec des expériences comportementales. Des précautions particulières doivent être prises concernant le calendrier de la stimulation. Synchronisation de l'photostimulation avec un comportement ou une tâche spécifique dans un appareil de comportement, notamment lors du conditionnement opérant, pourrait être décisif pour établir un lien causal entre l'activation des cellules et leur comportement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la compagnie d'assurance vie "Novalis Taitbout-", l'Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), l'Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" dans le cadre de «ERA-NET NEURON» de programme FP7 de la Commission européenne, «Fondation pour la Recherche Médicale", la Fondation Letten et de la Fondation Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
