Summary

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Published: December 28, 2011
doi:

Summary

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Abstract

Lokale interneuronen worden continu geregenereerd in de bulbus olfactorius van volwassen knaagdieren 1-3. In dit proces, de zogenaamde volwassen neurogenese, neurale stamcellen in de muren van de laterale ventrikel aanleiding geven tot neuroblasts die migreren van enkele millimeters langs de rostrale trekkende stroom (RMS) te bereiken en op te nemen in de bulbus olfactorius. De studie van de verschillende stappen en de impact van volwassen geboren neuron integratie in de reeds bestaande olfactorische circuits, is het noodzakelijk om selectief label en de activiteit van deze specifieke populatie van neuronen te manipuleren. De recente ontwikkeling van optogenetic technologieën biedt de mogelijkheid om licht te gebruiken om deze specifieke cohort van neuronen precies te activeren zonder dat dit invloed omliggende neuronen 4,5. Hier presenteren wij een reeks van procedures om viraal te uiten Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP in een tijdelijk beperkte cohort van neuroblasts in de RMS voordat ze de bulbus olfactorius en worden volwassen geboren neurons. Daarnaast hebben we laten zien hoe implantaat en kalibreren een miniatuur LED voor chronische in vivo stimulatie van ChR2-expressie neuronen.

Protocol

1. Stereotaxische injecties Het virus gebruikt in deze experimenten is een replicatie-deficiënte lentivirale vector op basis van het HIV-virus te Channelrhodopsine2-YFP (geel fluorescerend eiwit) te uiten fusieconstruct aangedreven door een synapsin promotor 6. Het plasmide werd royaal door K. Deisseroth 's onderzoeksgroep ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentivirussen kan worden verkregen u…

Discussion

Optogenetic tools hebben onlangs gestegen onze controle over de selectieve neuronale populaties, met inbegrip van volwassen geboren neuronen in de olfactorische systeem. Hier beschrijven we hoe u een stereotaxische injectie van een lentivirale vector die ChR2-YFP in een specifieke populatie van volwassen geboren neuronen uit te voeren. Door zorgvuldig toezicht op de periode na de injectie, zijn we in staat om te analyseren en manipuleren van de activiteit van een cohort van volwassen geboren neuronen met een relatief ho…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door het leven verzekeringsmaatschappij "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurowetenschappen de Paris (ENB), het Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" in het kader van "ERA-NET NEURON" van KP7 programma door de Europese Commissie, "Stichting pour la Recherche Medicale", de Letten Foundation en de Stichting Pasteur.

Materials

Material Company Catalogue No.
Ketamine Merial Imalgène 1000
Xylazine Bayer Health Care Rompum 0.2%
Pipette Puller Sutter P-97
Glass Capillaries (3.5″) Drummond Scientific 3-000-203-G/X
Nanoject II Microinjector Drummond Scientific 3-000-204
High speed surgical drill Fine Science Tools 18000-17
Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter Fine Science Tools 19008-07
LED CMS blue 4.6 W OSRAM LBW5SN
Female electrical connector (2.54 mm) Fischer Elektronik BL5.36Z
Current controller for LED (max: 1A) A1W Electronik HKO-KL50-1000
Pulse generator AMPI Master-8
Optical power meter Thor Labs PM100
Cyanoacrylate adhesive Loctite 454
Polycarboxylate cement (first layer cement) Septodont Selfast (#0068Q)
Methacrylate cement (second layer cement) GC InternationalCorp. Unifast Trad – Liquid (#339292)
Unifast Trad – Powder (#339114)
Carprofen Pfizer Rimadyl

References

  1. Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
  2. Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
  3. Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
  4. Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
  5. Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
  6. Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
  7. Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
  8. Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
  9. Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
  10. Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 .
  11. Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
  12. Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
  13. Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
  14. Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).

Play Video

Cite This Article
Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation. J. Vis. Exp. (58), e3380, doi:10.3791/3380 (2011).

View Video