Summary
嗅球のアダルト生まれのニューロンはoptogenetically Channelrhodopsin2発現吻側渡り鳥ストリームとLEDが注入されたミニチュアと慢性的な光刺激にレンチウイルス注入を使用して制御することができます。
Abstract
地元の介在は、連続して1月3日成人げっ歯類の嗅球に再生成されます。このプロセスでは、側脳室の壁の神経幹細胞は、嗅球に到達して組み込むことが吻側渡り鳥ストリーム（RMS）に沿って数ミリ程度のために移行する神経芽細胞を生じさせる、成体のニューロン新生と呼ばれる。異なる手順と嗅覚回路を既存のに成人生まれのニューロンの統合の影響を調べるために、それはニューロンのこの特定の集団の活性を選択的にラベルを付けたり、操作する必要があります。 optogenetic技術の最近の開発は、正確に4,5周囲のニューロンに影響を与えずに、ニューロンのこの特定のコホートをアクティブにするには、光を使用する機会を提供しています。ここで、我々は、彼らが嗅球に到達する前にRMSの神経芽細胞の時間的に制限されたコホートにおけるウイルス発現するChannelrhodopsin2（ChR2）- YFPへの一連の手順を提示し、成人生まれのNEになるurons。さらに、我々はChR2発現ニューロンの in vivo刺激で慢性のLEDミニチュアを移植し、キャリブレーションする方法を示します。
Protocol
1。定位注射
- これらの実験で使用されているウイルスは、エクスプレスChannelrhodopsine2 - YFP（黄色蛍光タンパク質）の融合は、シナプシンプロモーター6によって駆動される構築するためにHIVウイルスに基づいて複製欠損レンチウイルスベクターです。プラスミドは、寛大にK. Deisserothの研究グループ（によって提供されていましたhttp://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ）。レンチウイルスは、確立されたプロトコル7に記載の市販の供給源から入手または実験室で製造することができる。平均ベクトルの力価は、10 10形質導入単位/ mlのオーダーにあった。ウイルスのアリコートを-80℃で保存されており、ちょうどピペットのロード前に解凍する必要があります。複数の凍結/融解は避けてください。直接ドライアイスには決して暴露ウイルスソリューション。
- 標準ピペットプラー（サッターPのホウケイ酸ガラス毛細管を用いて、ガラスピペットを準備-97ピペットプラー）。引き設定が適切に長いと剛性ピペットを得るために校正する必要があります。次に、直径30〜40μmの先端を得るためにハサミを使用してピペットの先端をカット。ストアは、埃のないボックスにピペットを引っ張った。
- 50 NLの配信のためにメーカーの指示でNanoject IIマイクロインジェクターを設定します。ミネラルオイルでバック充填することによりインジェクションピペットを準備し、インジェクタープランジャーに入れて下さい。定位フレームにインジェクターを取り付けます。ウイルス溶液を充填する前に、ガラスピペットから部分的に空のオイル
- マイクロピペットで、パラフィルムの滅菌一部にウイルス溶液2μlを移す。優しくウイルス溶液の液滴にガラスピペットを下げ、1〜2μLをピペットを埋める。ピペット内に気泡がないことを確認してください。
- は100 mg / kgケタミンおよび滅菌生理食塩水で希釈した10 mg / kgのキシラジン、マウスを麻酔。の頭皮から髪を削除するげっ歯類のバリカン、かみそり、はさみ、または化学depilitory剤を用いて動物。 70％エタノールとbetadineを交互の3つのアプリケーションと頭皮を消毒する。すべての手術器具は、オートクレーブしてから、70％エタノールで消毒してください。頭がセキュアであることを保証する、耳のバーや鼻のバーと定位フレームに動物を置きます。角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。
- メスで、両目の間から耳の間に頭皮をカット。頭蓋骨を露出し、クランプのペアで皮膚を固定するために確保肌を引き出します。頭蓋骨の表面を清掃してください。定位固定装置は、ブレグマのガラスピペットの先端でゼロにされます。その後先端は注射部位（;メディオラテラル、それぞれ、左右半球のための± 0.82、、前部の後部、3.30）に配置されます。鼻のバーの位置が定位座標の計算に基づいて調整する必要があります。私たちの実験では、鼻のバーは、uを調整されntilブレグマと注射部位は、同じ高さに揃えられます。
- 注射部位を特定する。高速外科ドリルを使用して、慎重に頭蓋骨に穴を開けます。先端にフック曲がった注射針で、硬膜を露出させる薄い骨の残骸を削除します。穴が正しい位置を中心としていることを確認します。掘削中に脳の表面に破裂血管にしないように注意してください。血管が破裂している場合は、ゆっくりと血流が停止するまで数秒のための小さな綿棒やティッシュペーパーで脳の表面に押してください。
- ピペットを下げて、ピペットの先端は、脳の表面に触れると背腹の高さをゼロに。その後、正しい背腹の深さ（背腹、脳の表面から2.9）の下側との圧力平衡のために30秒待ちます。 200 NLの合計ウイルスの4倍の50 NLを注入する。各注入の間に30秒待ちます。
- 最後の注射から1分後、ゆっくりとパイプを撤回TTE。他の半球のためのポイント1.6から1.8を繰り返します。定位固定装置から動物を削除し、切開やステッチ外科のスレッドを使用してカット肌をきれいに。動物がケージに戻る前に温暖化パッドに回復することができます。さらに、動物は、直後に非ステロイド性抗炎症鎮痛剤（例えば、カルプロフェン4mg/kg）を与えられ、手術後3日間することができます。
2。嗅球における in vivo optogeneticの刺激で慢性のLED注入
- レンチウイルス粒子を注入された動物は、二国間で次の慢性的に小型青色LED（オスラム、LED CMS 4.6W青）で注入される。コネクタがLEDの反対側に配置されるようにメスミニチュア電気コネクタへのはんだは、LEDピン。電気的な近道がないことを確認し、コネクタの正および負のピンを識別する。適切なケーブルも、LEDの現在のコントローラに接続してLEDをテストします。
- 測定および/またはLEDの絶対的な光のパワーを設定するには、マウントマイクロマニピュレータとの位置にLEDが470nmのピーク光強度のパワーメータの光検出器と直接接触してLEDが。不透明な塩ビ板の直径3mmのピンホールを開けます。接辞は、このパワーメータにピンホールと光パワー対1mm 2あたりの消費電力を計算するために、入力電流の標準曲線を構築する。
- ° C ACSFはビブラトーム14を使用して0から4で脳を介して光の伝搬を測定するには、300の新鮮な脳組織のブロックをカット、500、1000、1500および2500μmの厚さ。 LEDの下に生きたマウスで行われたものと同一開頭と頭蓋骨の一部を置きます。最初に、LEDを中心に組織することなく光パワーを測定する。その後、LEDとパワーメータの光検出器の間の組織の各ブロックを配置し、電力を測定する。比率として計算された組織の厚さに対する相対的な透過率の曲線を、構築する組織を通じて、組織のない測定した電力間。
- は100 mg / kgケタミンおよび滅菌生理食塩水で希釈した10 mg / kgのキシラジン、マウスを麻酔。 70％エタノールでLEDを清掃し、消毒する。動物の頭皮から髪を削除し、70％エタノールとbetadineを交互の3つのアプリケーションと頭皮を消毒する。その後、定位フレームに動物を配置。角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。定位ホルダーにコネクターを取り付けます。嗅球上の頭蓋骨の表面は完全に水平とミニチュアの表面のLEDと平行になるまで鼻のバーの位置を調整する必要があります。
- メスで、耳の後方3mmまで目に前方3mmから頭皮をカット。わきの皮膚を引っ張り、クランプのペアとそれを固定してください。カミソリの刃を使用して頭蓋骨の表面に膜を削り取る。頭蓋骨を清潔で乾燥した。その後の広告を許可するようにシアノアクリレート接着剤の薄いカバーを適用する歯科アクリルのhesion。
- 嗅球上、高速な手術ドリルを使用して、長方形の開頭（5.1ミリメートル尾を中心に、ブレグマから横方向0ミリメートル尾1mmと横3mm）を行います。慎重に薄い頭蓋骨、これを行うには骨の唯一の薄層が残っているまで。慎重に曲がった注射針の助けを借りて、残りの骨を取り除く。特別なケアは、硬膜を穿刺し、二つの半球間および嗅球の尾側縁に位置する主要な血管を破裂を避けるために注意する必要があります。脳の表面での血液の蓄積と凝固は、組織に最適な光の侵入を排除する。開頭し、滅菌生理食塩水で脳の表面を洗い流してから頭蓋骨を乾燥させる。
- コネクタにLEDのミニチュアを取り付けます。嗅球の上部にあるLEDミニチュアを下ろします。ミニチュアLEDの主軸は、滅菌生理食塩水とdとクリーンマウスの吻側 - 尾側軸に平行でなければなりませんRY頭蓋骨。その後、歯科アクリルの二層に続いてアクリルの最初の層（ すなわち 、ポリカルボキシレートセメント）と頭蓋骨、LEDを固定します。二つの小さなネジの加算は、LEDを修正するために必要となる場合があります。ネジは頭蓋骨に挿入（LEDの位置まで後方）との両方アクリルで覆われるべきである。アクリルはまだ液体である間、歯のアクリルの表面に頭皮のフリーエッジを引き戻すと接着剤。コネクタ上の任意のアクリルを適用しないように注意してください。アクリルが硬化した後は、定位固定装置から動物を取り外して、ケージに戻す前に、温暖化のパッドの上にリカバリできます。動物は、少なくとも7日間の手術から回復するために彼らのケージで隔離さ残っている。さらに、動物は、直後に非ステロイド性抗炎症鎮痛剤（例えば、カルプロフェン4mg/kg）を与えられ、手術後3日間することができます。 LEDは、実験着床前と終了後にテストする必要があります。
- 光電気CALケーブルは、LEDのタイミングと強度を制御するパルス発生器（マスター- 8）に結合したLEDの電流制御器へのテザー動物のために使用されます。細いケーブルは、運動の完全な自由を可能にする。コネクタの極性を尊重するように注意してください。極性を反転させると、LEDが破損する恐れがあります。
3。代表的な結果：
ChR2 - YFPは、約48時間注入後の神経細胞を形質導入で発現しており、数ヶ月7のために安定しています。図1は、パラホルムアルデヒド固定動物の矢状断面15日間注射後の代表的な絵です。密なラベリングとRMSで注射部位のサイズに注意してください。新生児の細胞の多数は嗅球（図1）の異なる層を植民地化するRMSに沿って移行しています。融合タンパク質は、細胞体、樹状突起、および背骨を含むすべてのニューロンのコンパートメント、で表されます。
ミニチュアLED impla ntationは大規模と関心の広範な地域の安価な光刺激することができます。動物は動きの完全な自由を可能にする光電気ケーブルとLEDコントローラにつながれている。脳組織における光の拡散とChR2活性化の閾値を特徴付けることによって、我々は、光活性化がLED（図2A）の表面の下に〜2mmの深さでトリガーすることができると推定している。の機能的活性化を監視するためにin vivoでの神経細胞をChR2を発現、c - fosの、神経活動のマーカーの発現は、反復的な光刺激（図2B）の後に分析することができます。別の方法として、焦点距離、光の刺激に結合ChR2発現ニューロンの in vitro電気生理学的記録の 14を実行することができます。最後に、2光子標的ルーズパッチ録音は in vivo 9 に LEDが同様のミニチュアでChR2発現皮質神経細胞の機能的活性化を研究するために使用されている。
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図1。レンチウイルスの注射から吻側渡り鳥ストリームにChR2 - YFP発現15日後の吻側RMSのレンチウイルスの注射後のマウスの嗅球のsaggitalセクションの代表的な共焦点画像は、。 RMSの端からOBの別の層に移行する散乱YFP新生ニューロンの存在に注意してください。新生児の細胞（95％）のほとんどは、顆粒細胞層（GCL）と樹状突起の細胞体の嘘が外部網状層（EPL）の樹枝状にする顆粒細胞、です。新生ニューロンの小集団は、球状層におけるOBの最浅層部、（GL）まで移行する。スケールバー、100μmの。樹状突起にだけでなく、棘のChR2 - YFPの膜発現を示す新生児顆粒細胞のはめ込み、高倍率、。スケールバー、20μmの。
図2。移植の図は、嗅球と新しい顆粒細胞を表すChR2 - YFPの光誘発c - fos発現の上にLEDが点灯します。
注入された嗅球上のLEDの、模式図。
B、一時間嗅球の光刺激後の二重標識ChR2 - YFP + c - fosの+顆粒細胞を示す代表的な共焦点画像。 C - fos発現は、ウサギ抗- c - fosの一次抗体（Calbiochem社、1:5000）とA568 -結合抗ウサギ二次抗体（Invitrogen社、1:1000）を用いて明らかにされる。スケールバー、10μmの。
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Discussion
Optogeneticツールは、最近、嗅覚系における成人生まれたニューロンを含む選択的な神経集団、上の私たちのコントロールを増加している。ここでは、成人生まれのニューロンの特定の集団にChR2 - YFPの発現レンチウイルスベクターの定位注射を行う方法について説明します。注意深く期間ポスト噴射を監視することによって、我々は相対的に均質年齢の成人生まれのニューロンの集団の活動を分析し、操作することができます。
が低いため拡散の広がり、その高い導入効率とRMSの神経芽細胞のためのそれらの相対的な良い親和性から、レンチウイルスベクターは、レトロウイルスやアデノ随伴ウイルス（AAV）のような他のウイルスベクターに比べて支持されるべきである。彼らは選択的にそのような幹細胞や前駆細胞などの分裂細胞に感染するので、レトロウイルスベクターは、脳室下帯に注入し、新生ニューロンの小さな人口を伝達する必要があります。レンチウイルスVと比較してectorsは、AAVベクターは、感染症のはるかに高いスプレッドを提供しています。ただし、RMSの神経芽細胞のAAV形質導入があるためこのような副嗅覚核、戻って嗅球へのプロジェクトの軸索は、その地域としての周囲の構造物の伝達を避ける必要があります。最後に、移植されたLEDの使用は、そのようなChR2発現はウイルスベクターを介して、またはトランスジェニックマウスのライン10を介して神経細胞の特定の集団で駆動されている皮質領域として、脳の他の表面的な構造物に適用することができます。
LEDの注入で、我々は目を覚まし振る舞う動物における嗅球の成体の神経新生の機能的役割を研究するために慢性的な光刺激を適用することができます。このシンプルな光源は、LEDの速度のオン/オフ本質的に急速に光感謝の速い時間的な制御を提供します。安価であることに加えて、小型のLED光源は、脳の大音量でChR2活性化のための十分なパワー（〜100mWの）を生成組織11、さらに両側嗅球の場合。これは重要な病変は、嗅上皮の12からの入力で高度な冗長性に 起因する臭気の質の知覚に影響することなく可能性があるこの脳の領域では特に重要です。そのパワーとスペクトル帯域幅（25nmの）のおかげで、これらの小型のLEDはChR2だけでなく、ChETAなどやキャッチchannelrhodopsinsの他のバージョンを使用して光誘発励起に使用されることがあります。ミニチュア黄色（597nm）と赤（624または637nm）のLEDは、ハロロドプシンとVChR1 13と赤色シフトロドプシンに使用される可能です。
ミニチュアLEDはまた、限界を示す。脳を加熱回避するために、妥協はパルス幅、パルス周波数、および光強度の間に発見されている必要があります。例えば、5ミリ秒の短い光パルスは、高周波数（> 20Hzの）と100mWの光強度で推奨されています。この期間、signific上記周囲の組織内の温度（〜1月4日° C）の蟻の標高を測定することができます。このパラメータは、特にハロロドプシンを用いた光誘発過分極の場合には、長い光パルス（> 5msの）または連続光刺激のために考慮する必要があります。さらに、LEDを供給し、現在は、LEDが組織と直接接触しているときに生体電気生理学的記録に排除することができる強力な電気的アーティファクトを、提供します。レーザー結合光ファイバーは小さく、より制限された光刺激を可能に、可能な選択肢を構成する。しかし、光ファイバーの剛性は、特定の動作を妨げる可能性があります。
光による光浸透し、神経細胞の機能的な刺激を把握後、 生体内で光刺激は、行動実験との組み合わせでトリガすることができます。特別なケアは、刺激のタイミングについては注意が必要です。 photostimuの同期特にオペラント条件付け時の行動の装置で特定の動作またはタスクとのlationは、細胞の活性化と行動の因果関係を確立するための決定的である可能性があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、の"ERA - NET NEURON"のフレームで"ANR - 09 - neuro -の異形004"エコールデ神経科学パリ（ENP）、アジャンス国立デラルシェルシュ、"ノヴァーリス- Taitbout"生命保険会社によってサポートされていました欧州委員会によるFP7のプログラム、"財団流動アラカルトルシェルシュMedicale"、Letten財団とパスツール財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
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