Summary
Las neuronas nacidas de adultos del bulbo olfatorio puede ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 que expresan lentiviral inyección en la corriente migratoria rostral y fotoestimulación crónica con una miniatura implantado LED.
Abstract
Interneuronas locales se regeneran continuamente en el bulbo olfativo de los roedores adultos 1-3. En este proceso, denominado neurogénesis adulta, las células madre neurales en las paredes de los ventrículos laterales dan origen a los neuroblastos que migran de varios milímetros a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) para alcanzar e incorporar en el bulbo olfatorio. Para el estudio de los diferentes pasos y el impacto de la integración de las neuronas adultas de origen en los circuitos preexistentes olfativo, es necesario etiquetar y manipular de forma selectiva la actividad de esta población específica de las neuronas. El reciente desarrollo de las tecnologías de optogenetic ofrece la oportunidad de utilizar la luz para activar precisamente este grupo específico de neuronas sin afectar a las neuronas circundantes 4,5. A continuación, presentamos una serie de procedimientos para expresar de forma viral Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP en una cohorte temporalmente restringido de neuroblastos en el RMS antes de llegar al bulbo olfatorio y se hacen adultos nacidos en neurons. Además, se muestra cómo se implante y calibrar una miniatura de LED para la estimulación crónica en vivo de ChR2 neuronas que expresan.
Protocol
1. Estereotáxica inyecciones
- El virus utilizado en estos experimentos es un vector lentiviral replicación deficiente basada en el virus del VIH para expresar Channelrhodopsine2-YFP (proteína fluorescente de color amarillo) construcción de fusión controlado por un promotor sinapsina 6. El plásmido fue generosamente proporcionada por K. Deisseroth 's del grupo de investigación ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Los lentivirus se puede obtener de fuentes comerciales o producidos en el laboratorio de acuerdo a los protocolos establecidos 7. Los títulos de promedio de vectores fueron del orden de 10 10 unidades de transducción / ml. Alícuotas viral se almacenan a -80 ° C y debe ser descongelado antes de la carga de pipeta. Múltiples de congelación / descongelación ciclos deben ser evitados. Nunca la exposición del virus de la solución directamente en hielo seco.
- Prepare pipetas de vidrio de borosilicato con capilares de vidrio en el estándar pipeta extractor (Sutter P-97 Pipeta asistente de cámara). La configuración de tracción debe estar adecuadamente calibrado para obtener una pipeta larga y rígida. A continuación, corte la punta de la pipeta con un par de tijeras para obtener una propina de 30 a 40 micras de diámetro. Tienda sacó pipetas en una caja libre de polvo.
- Configuración de la Nanoject II microinyector con las instrucciones del fabricante para la entrega de 50 nL. Prepare la pipeta de inyección de back-llenado con aceite mineral y la inserta en el émbolo microinyector. Conecte el microinyector en un marco estereotáxico. El aceite parcialmente vacío de la pipeta de vidrio antes de llenar con la solución de virus
- Con una micropipeta, de transferencia de 2 l de solución de virus en un trozo de Parafilm estéril. Baje suavemente la pipeta de vidrio dentro de la gota de la solución de virus y llenar la pipeta con 2.1 l. Asegúrese de que no hay burbujas de aire en la pipeta.
- Anestesiar a un ratón con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina, diluida en solución salina estéril. Quitar el pelo del cuero cabelludo de laanimales utilizando tijeras de roedores, maquinilla de afeitar, tijeras, o un agente químico depilitory. Desinfectar el cuero cabelludo con tres aplicaciones de alternancia de etanol al 70% y el betadine. Todos los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse en autoclave y luego desinfectar con alcohol al 70%. Colocar el animal en el marco estereotáxico con las barras de los oídos y la nariz de barras, asegurando que la cabeza es seguro. Aplique una pomada ocular para prevenir la sequedad de la córnea.
- Con un bisturí, cortar el cuero cabelludo de entre los ojos de entre las orejas. Tire de la piel a un lado para exponer el cráneo y el anclaje de la piel con un par de pinzas. Limpie la superficie del cráneo. El aparato estereotáxico se pone a cero con la punta de la pipeta de vidrio en el bregma. Entonces la punta se coloca en el sitio de la inyección (antero-posterior, 3,30; medio-lateral, ± 0,82, para ambos hemisferios derecho e izquierdo, respectivamente). La posición de la barra de la nariz debe ser ajustada de acuerdo con el cálculo de las coordenadas estereotáxica. En nuestro experimento, la barra de la nariz se ajusta uasta bregma y el sitio de inyección están alineados a la misma altura.
- Identifique el sitio de inyección. Usando un taladro quirúrgico de alta velocidad, con cuidado agujeros en el cráneo. Con una aguja de jeringa doblada enganchada en la punta, quitar los restos de hueso fino para exponer la duramadre. Compruebe que el agujero se centra en la posición correcta. Tenga cuidado de no romper los vasos sanguíneos en la superficie del cerebro durante la perforación. Si los vasos sanguíneos se rompen, presione suavemente sobre la superficie del cerebro con un bastoncillo de algodón o tejido pequeños durante varios segundos hasta que el flujo sanguíneo se detiene.
- Inferior de la pipeta y el cero de la altura dorso-ventral en la punta de la pipeta toque la superficie del cerebro. A continuación, baje a la profundidad correcta dorso-ventral (dorso-ventral, el 2,9 de la superficie del cerebro) y esperar 30 segundos para el equilibrio de presión. Se inyecta 4 veces 50 nl de virus para un total de 200 nl. Espere 30 segundos entre cada inyección.
- Un minuto después de la última inyección, extraiga lentamente la tuberíatte. Repita los puntos 1.6-1.8 para el otro hemisferio. Quitar el animal de aparato estereotáxico, limpiar la incisión y el punto de corte de la piel con hilos quirúrgicos. Que el animal pueda recuperarse en la plataforma de calentamiento antes de regresar a la jaula. Además, los animales se puede dar un no-esteroides anti-inflamatorios analgésicos (por ejemplo, carprofeno 4mg/kg) inmediatamente después y tres días después de la cirugía.
2. Implantación crónica LED para la estimulación optogenetic vivo en el bulbo olfatorio
- Los animales inyectados con partículas lentiviral bilateral están al lado implantados en forma permanente con un LED azul en miniatura (Osram, LED CMS 4.6W azul). Soldadura de los pines LED a una hembra de conectores eléctricos en miniatura para que el conector se coloca en el lado opuesto de la LED. Compruebe que no hay atajos eléctricos e identificar el pin positivo y negativo en el conector. Pruebe el LED mediante la conexión a un controlador de corriente de LED a través de un cable adecuado.
- Para medir y / o establecer el poder absoluto de la luz del LED, el LED de montaje en un micromanipulador y la posición del LED en contacto directo con la célula fotoeléctrica de un medidor de potencia de un pico de intensidad de la luz a 470 nm. Perforar un agujero de 3 mm de diámetro en una placa opaca de PVC. Coloque este agujero con el medidor de potencia y construir una curva de nivel de potencia óptica frente a la corriente de entrada para calcular la potencia por 2 mm.
- Para medir la propagación de la luz a través del cerebro, cortar los bloques de tejido cerebral fresco de 300, 500, 1000, 1500 y 2500 m de espesor en 0-4 º C con un ACSF vibratome 14. Coloque un pedazo de cráneo con una craneotomía idéntica a la realizada en ratones vivos en el LED. En primer lugar, medir la potencia de la luz sin el tejido centrado en LED. Luego, coloque cada bloque de tejido entre el LED y el fotodetector del medidor de potencia, y medir el poder. Construir una curva de espesor de los tejidos frente a la transmisión de la fracción relativa, calculada como el cocienteentre la potencia medida a través del tejido y sin tejido.
- Anestesiar a un ratón con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina, diluida en solución salina estéril. Limpie y desinfecte el LED con el 70% de etanol. Quitar el pelo del cuero cabelludo de los animales y desinfectar el cuero cabelludo con tres aplicaciones de la alternancia del 70% de etanol y betadine. A continuación, coloque el animal en el marco estereotáxico. Aplique una pomada ocular para prevenir la sequedad de la córnea. Enchufe el conector a un titular estereotáxica. La posición de la barra de la nariz debe ser ajustada hasta que la superficie del cráneo por encima del bulbo olfatorio es perfectamente horizontal y paralela a la superficie de la miniatura LED.
- Con un bisturí, cortar el cuero cabelludo de 3 mm por delante de los ojos a 3 mm por detrás de las orejas. Tire de la piel a un lado y fijarlo con un par de pinzas. Raspe las membranas en la superficie del cráneo una hoja de afeitar. Limpie y seque el cráneo. Aplicar una capa delgada de pegamento instantáneo para permitir anuncios posteriorescohesión de acrílico dental.
- Usando un taladro quirúrgico de alta velocidad, realizar una craneotomía rectangular (1 mm y 3 mm de caudal lateral, centrado en 5,1 mm caudal, 0 mm lateral de bregma) en los bulbos olfatorios. Para ello, cuidadosamente delgada del cráneo hasta que sólo quede una fina capa de restos óseos. Retire con cuidado el hueso restante con la ayuda de una aguja de jeringa dobladas. Especial cuidado se debe tomar para evitar la punción de la materia dura y la ruptura de los vasos sanguíneos principales que se encuentran entre los dos hemisferios y en el borde caudal de los bulbos olfatorios. La acumulación de sangre y coagulación en la superficie del cerebro se opone a la penetración óptima de la luz en el tejido. Enjuague la craneotomía y la superficie del cerebro con solución salina estéril y seco en el cráneo.
- Conecte el LED en miniatura en el conector. Baje la miniatura LED en la parte superior de los bulbos olfatorios. El eje principal de la miniatura LED debe ser paralela al eje rostral-caudal del ratón, limpieza con solución salina estéril y dry el cráneo. Luego asegure el LED en el cráneo con una primera capa de acrílico (cemento, es decir, policarboxilato), seguido por una segunda capa de acrílico dental. La adición de dos pequeños tornillos puede ser necesaria para corregir el LED. Los tornillos deben ser insertados en el cráneo (por detrás de la posición de LED) y se cubre con los acrílicos. Mientras que el acrílico es todavía líquida, tire hacia atrás y pegar los bordes libres del cuero cabelludo en la superficie del acrílico dental. Tenga cuidado de no aplicar ningún tipo de acrílico en el conector. Después de que el acrílico se ha endurecido, retirar el animal del aparato estereotáxico y dejar que se recuperen en un cojín de calentamiento antes de regresar a la jaula. Los animales se quedan aislados en su jaula para recuperarse de la cirugía por lo menos durante siete días. Además, los animales se puede dar un no-esteroides anti-inflamatorios analgésicos (por ejemplo, carprofeno 4mg/kg) inmediatamente después y tres días después de la cirugía. LEDs deben ser probados antes de la implantación y después de la terminación de los experimentos.
- A la luz eléccal cable se utiliza para atar al animal a un regulador de corriente de LED acoplado a un generador de impulsos (Master-8) para controlar el ritmo y la intensidad de los LED. El cable delgado permite una total libertad de movimiento. Tenga cuidado de respetar la polaridad del conector. La inversión de la polaridad puede romper el LED.
3. Los resultados representativos:
ChR2-YFP se expresa en neuronas transducidas aproximadamente 48 horas después de la inyección, y se mantiene estable desde hace varios meses 7. La figura 1 es una imagen representativa de una sección sagital de un animal de paraformaldehído-fijo 15 días después de la inyección. Tenga en cuenta el etiquetado denso y el tamaño del sitio de la inyección en el RMS. Un gran número de células recién nacidas han migrado a lo largo de la RMS para colonizar las distintas capas del bulbo olfatorio (Fig. 1). La proteína de fusión se expresa en todos los compartimentos neuronales, incluyendo el soma, dendritas y espinas.
Miniatura LED impla ntation permite a gran escala y bajo costo estimulación óptica de una amplia región de interés. El animal está atado con el controlador LED con un cable de luz eléctrica que permite una total libertad de movimiento. Al caracterizar a la difusión de la luz en el tejido cerebral y el umbral de activación del ChR2, se estima que la activación óptica puede ser activado a una profundidad de ~ 2 mm por debajo de la superficie del LED (Fig. 2A). Para controlar la activación funcional de ChR2 neuronas que expresan in vivo, la expresión de c-fos, un marcador de actividad neuronal, se puede analizar la luz después de la estimulación repetitiva (Fig. 2B). Como alternativa, en los registros electrofisiológicos in vitro de neuronas que expresan ChR2 junto a la estimulación de luz focal se pueden realizar 14. Por último, dos fotones dirigidos sueltas parche grabaciones se han utilizado para estudiar la activación funcional de ChR2 que expresan las neuronas corticales en miniatura similares LED en vivo 9.
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Figura 1. ChR2-YFP expresión de la inyección de lentivirus en la corriente migratoria rostral. Confocal imágenes representativas de las secciones sagital del bulbo olfativo de un ratón de 15 días después de la inyección de un lentivirus de la rostral RMS. Tenga en cuenta la presencia de neuronas dispersas YFP recién nacidos migran desde el final de la RMS de las diferentes capas de la OB. La mayoría de las células de recién nacidos (95%) son las células granulares, que se encuentran en el soma de la capa de células granulares (GCL) y las dendritas se ramifican en la capa plexiforme externa (EPL). Una pequeña población de neuronas recién nacidas emigran hasta la capa más superficial de la obstetricia, en la capa glomerular (GL). Barra de escala, 100μm. Ampliación de la inserción de alta de un recién nacido de células granulares, que muestra la expresión en la membrana de ChR2-YFP en las dendritas, así como en las espinas. Barra de escala, 20μm.
Figura 2. Diagrama de implantar LED en la parte superior del bulbo olfatorio y la luz evoca la expresión de c-fos en ChR2-YFP células que expresan el nuevo gránulo.
Un dibujo, Esquema de los LED implantados por encima de los bulbos olfatorios.
B, Representante confocal de imágenes que muestran doble etiquetado ChR2-YFP + c-fos células granulares + una hora después de la estimulación de la luz del bulbo olfatorio. C-fos expresión se revela con un conejo anti-c-fos anticuerpo primario (Calbiochem, 1:5000) y A568-conjugado anti-conejo secundaria de anticuerpos (Invitrogen, 1:1000). Barra de escala, 10μm.
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Discussion
Herramientas Optogenetic han aumentado recientemente el control sobre selectiva poblaciones neuronales, incluyendo los adultos las neuronas nacidas en el sistema olfativo. A continuación se describe cómo realizar una inyección estereotáxica de un vector lentiviral expresar ChR2-YFP en una población específica de los adultos nacidos en las neuronas. Controlando cuidadosamente el período post-inyección, que son capaces de analizar y manipular la actividad de una cohorte de adultos nacidos en las neuronas con una edad homogénea relativa.
Debido a su propagación baja difusión, su alta eficiencia de transducción y su tropismo relativa buena para los neuroblastos de la RMS, vectores lentiviral debe ser favorecido en comparación con otros vectores virales tales como retrovirus o virus adeno-asociados (AAV). Debido a que selectivamente infectar células que se dividen, como las células madre o progenitoras, los vectores de retrovirus se debe inyectar en la zona subventricular y la transducción de una población más pequeña de las neuronas recién nacidas. En comparación con lentiviral vectores, vectores AAV ofrecer una difusión mucho mayor de infección. Sin embargo, la transducción de AAV de neuroblastos en el RMS se debe evitar debido a la transducción de las estructuras circundantes tales como el núcleo olfativo accesorio, una región que los proyectos de los axones de nuevo en el bulbo olfatorio. Por último, el uso de LEDs implantado se puede aplicar a otras estructuras superficiales del cerebro, tales como las regiones corticales en el cual es impulsado ChR2 expresión en poblaciones específicas de neuronas a través de vectores virales o por medio de una línea de ratones transgénicos 10.
Con la implantación de LED, que son capaces de aplicar la estimulación crónica ópticos para estudiar el papel funcional de la neurogénesis adulta olfativa bombilla despierto animales que se comportan. Esta fuente de luz simple proporciona un rápido control temporal de la luz gracias a la intrínseca rápido encendido / apagado de velocidad de los LED. Además de ser barato, una miniatura fuente de luz LED produce suficiente energía (~ 100 mW) para la activación de ChR2 en un gran volumen del cerebro11 tejidos, incluso de forma bilateral en el caso de los bulbos olfatorios. Esto es particularmente importante en esta región del cerebro donde las lesiones pueden ser significativas, sin efecto sobre la percepción del olor de calidad debido a un alto grado de redundancia en las entradas de los 12 epitelio olfatorio. Gracias a su poder y su ancho de banda espectral (25 nm), estos indicadores LED en miniatura puede ser usado para la luz, evoca la excitación con ChR2, así como versiones de otros channelrhodopsins como Cheta o captura. Miniatura de color amarillo (597nm) y rojo (624 o 637nm) LEDs están disponibles para ser utilizados para desplazada hacia el rojo rodopsinas como halorhodopsina y VChR1 13.
LEDs en miniatura también muestran limitaciones. Para evitar el calentamiento del cerebro, un compromiso que debe buscarse entre la duración del pulso, la frecuencia del pulso y la intensidad de la luz. Por ejemplo, pulsos cortos de luz de 5 milisegundos se recomiendan en las frecuencias altas (> 20 Hz) e intensidad de luz de 100 mW. Por encima de este tiempo, un significelevación de la hormiga de la temperatura (~ 1.4 ° C) en el tejido circundante se puede medir. Este parámetro debe ser tenido en cuenta por más pulsos de luz (> 5 ms) o la estimulación de luz continua, especialmente en el caso de la luz-evocada con hiperpolarización halorhodopsina. Además, la corriente que alimenta el LED proporciona una fuerte artefacto eléctrico, que puede impedir que en los registros electrofisiológicos in vivo cuando el LED está en contacto directo con el tejido. Láser acoplado fibras ópticas constituyen una alternativa posible, lo que permite una estimulación más pequeños y más restringida óptica. Sin embargo, la rigidez de las fibras ópticas pueden interferir con ciertos comportamientos.
Después de caracterizar de la penetración de la luz y la estimulación funcional de las neuronas por la luz, en la estimulación óptica vivo puede ser activado en combinación con los experimentos de comportamiento. Especial cuidado se debe tomar con respecto al momento de la estimulación. La sincronización de la photostimución con un comportamiento específico o una tarea en un aparato de comportamiento, especialmente durante el condicionamiento operante, podría ser decisivo para establecer un vínculo causal entre la activación de células y su comportamiento.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la compañía de seguros de vida "Novalis-Taitbout", Escuela de Neurociencias de París (PEV), la Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" en el marco de la "ERA-NET NEURON" de 7PM programa por la Comisión Europea, "Fundación pour la Recherche Medicale", la Fundación Letten y la Fundación Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
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