Summary
Adult-geboren Neuronen des Bulbus kann optogenetically gesteuert werden mit Channelrhodopsin2-exprimierenden lentiviralen Injektion in den rostralen wandernde Bach und chronischen Photostimulation mit einem implantierten Mini-LED.
Abstract
Lokale Interneurone werden kontinuierlich in den Riechkolben der erwachsenen Nagetieren 1-3 regeneriert. In diesem Prozess, genannt adulte Neurogenese, neuronale Stammzellen in den Wänden der Seitenventrikel Anlass zu Neuroblasten, die für mehrere Millimeter entlang der rostralen wandernden Strom (RMS) zu erreichen und in den Riechkolben enthalten migrieren. Zur Untersuchung der verschiedenen Schritte und die Auswirkungen der Erwachsenen-geboren Neuron Integration in bereits vorhandene Geruchs-Schaltungen ist es notwendig, gezielt Label und Manipulation der Aktivität dieser speziellen Population von Neuronen. Die jüngste Entwicklung der optogenetische Technologien bietet die Möglichkeit, Licht zu verwenden, um genau zu aktivieren diese spezifische Gruppe von Neuronen, ohne die umliegenden Neuronen 4,5. Hier präsentieren wir eine Reihe von Verfahren, die viral ausdrückliche Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP in einer zeitlich beschränkten Gruppe von Neuroblasten in der RMS, bevor sie den Riechkolben zu erreichen und zu Erwachsenen-geboren neurons. Darüber hinaus zeigen wir, wie zu implantieren und zu kalibrieren eine Miniatur für chronische in vivo Stimulation von ChR2-exprimierenden Neuronen LED.
Protocol
1. Stereotaktische Injektion
- Das Virus in diesen Experimenten verwendet wird ein Replikations-defizienten lentiviralen Vektors auf das HIV-Virus basiert auf Channelrhodopsine2-YFP (gelb fluoreszierendes Protein) exprimieren Fusionskonstrukt angetrieben von einem Synapsin Förderer 6. Das Plasmid wurde freundlicherweise von K. Deisseroth 's Research Group (sofern http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentiviren können im Handel bezogen werden oder im Labor hergestellt nach etablierten Protokollen 7. Durchschnittliche Vektor-Titer wurden in der Reihenfolge 10 10 Transduktion Einheiten / ml. Viral Aliquots bei -80 ° C gelagert und sollte kurz vor Pipette loading aufgetaut werden. Mehrere Frost / Tau-Zyklen sollte vermieden werden. Nie Exposition der Virus-Lösung direkt auf Trockeneis.
- Bereiten Glaspipetten mit Borosilikatglas Kapillaren auf Standard-Pipette Puller (Sutter P-97 Pipette puller). Das Ziehen Einstellung sollte richtig kalibriert werden, um eine lange und starre Pipette erhalten. Anschließend schneiden Sie die Spitze der Pipette mit einer Schere, um ein Trinkgeld von 30-40 &mgr; m im Durchmesser erreichen. Shop gezogen Pipetten in einer staubfreien Box.
- Richten Sie die Nanoject II Mikroinjektor mit den Anweisungen des Herstellers für die Lieferung von 50 nL. Bereiten Sie die Injektionspipette von Back-Füllung mit Mineralöl und fügen Sie ihn in den Mikroinjektor Kolben. Bringen Sie die Mikroinjektor auf einen stereotaktischen Rahmen. Teilweise leere Öl aus der Glaspipette vor dem Befüllen mit der Virus-Lösung
- Mit einer Mikropipette, Transfer 2 ul-Virus-Lösung auf eine sterile Stück Parafilm. Senken Sie die Glaspipette in die Drop-Virus-Lösung und füllen Sie die Pipette mit 1-2 pl. Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen in der Pipette.
- Anesthetize eine Maus mit 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin, in steriler Kochsalzlösung verdünnt. Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut desTier mit Nagetier Klipper, Rasierklingen, Scheren oder chemische depilitory Agenten. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei Anwendungen von Wechselstrom 70% Ethanol und betadine. Alle chirurgischen Instrumente sollten auch autoklaviert werden und dann mit 70% Ethanol desinfiziert. Legen Sie das Tier in den stereotaktischen Rahmen mit Ohr Bars und Nase bar, sicherzustellen, dass der Kopf sicher ist. Übernehmen Augensalbe zu verhindern Austrocknen der Hornhaut.
- Mit einem Skalpell, schneiden Sie die Kopfhaut vor zwischen den Augen, zwischen den Ohren. Ziehen Sie die Haut beiseite, um den Schädel zu entlarven und verankern Sie die Haut mit einem Paar Klammern. Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels. Die stereotaktischen Apparat ist mit der Spitze der Glaspipette auf Bregma auf Null gestellt. Dann wird die Spitze an der Injektionsstelle (; Medio-Lateral, ± 0,82, für beide rechten und linken Hemisphäre bzw. von vorne nach hinten, 3,30) positioniert. Die Position der Nase bar ist nach der Berechnung der stereotaktischen Koordinaten angepasst werden. In unserem Experiment ist die Nase bar u eingestelltntil Bregma und der Injektionsstelle sind auf die gleiche Höhe ausgerichtet.
- Identifizieren Sie die Einstichstelle. Mit einem High-Speed-chirurgische Bohrer vorsichtig bohren Löcher in die Schädel. Mit einer gebogenen Kanüle an der Spitze angeschlossen, entfernen Sie die Reste der dünnen Knochen, die Dura mater aussetzen. Prüfen Sie, ob das Loch an der richtigen Stelle zentriert ist. Achten Sie darauf, nicht zu brechen Blutgefäße auf der Oberfläche des Gehirns während des Bohrens. Wenn Blutgefäße zerrissen sind, vorsichtig auf die Oberfläche des Gehirns mit einem kleinen Wattestäbchen oder Gewebe für mehrere Sekunden drücken, bis der Blutfluss stoppt.
- Senken Sie die Pipette und Null der Dorso-Ventral Höhe, wenn die Spitze der Pipette berührt die Oberfläche des Gehirns. Dann, um die richtige Dorso-Ventral Tiefe (Dorso-Ventral, 2,9 von Hirnoberfläche) niedriger und warten Sie 30 Sekunden für Druckausgleich. Inject 4 mal 50 nl von Viren für eine Gesamtmenge von 200 nl. Warten Sie 30 Sekunden zwischen jeder Injektion.
- Eine Minute nach der letzten Injektion langsam zurückziehen Rohrtte. Wiederholen Sie die Punkte 1,6-1,8 für die andere Hemisphäre. Entfernen Sie das Tier von stereotaktischen Apparat, reinigen Sie den Schnitt und Stich der Schnitt Haut mit chirurgischen Fäden. Lassen Sie das Tier auf die Erwärmung pad vor der Rückkehr in Käfig zu erholen. Darüber hinaus können Tiere eine nicht-steroidale entzündungshemmende Schmerzmittel (zB Carprofen 4mg/kg) unmittelbar nach gegeben und 3 Tage nach der Operation.
2. Chronische LED Implantation in vivo optogenetische Stimulation im Riechkolben
- Tiere mit lentiviralen Partikel injiziert bilateral nächsten chronisch mit einem Miniatur-blauen LED (Osram, LED CMS 4.6W blau) implantiert. Löten Sie die LED-Pins, um eine weibliche Mini-Elektro-Anschluss, so dass der Stecker auf der gegenüberliegenden Seite der LED positioniert ist. Überprüfen Sie, dass es keinen elektrischen Kurzschluss und identifizieren Sie die positiven und negativen Pin am Stecker. Testen Sie die LED durch den Anschluss an einen Stromregler denn wenn Sie ein passendes Kabel LED.
- Zur Messung und / oder setzt die absolute Lichtleistung der LED, montieren Sie die LED auf einem Mikromanipulator und die Position der LED in direkten Kontakt mit dem Photodetektor ein Leistungsmesser eines Peaks Lichtintensität bei 470 nm. Bohren Sie ein Loch von 3 mm Durchmesser in einem undurchsichtigen PVC Bord. Bringen Sie dieses Loch auf die Power-Meter und bauen eine Standardkurve der optischen Leistung im Vergleich zu Eingangsstrom auf die Leistung pro mm 2 zu berechnen.
- Zur Messung der Ausbreitung von Licht durch das Gehirn, schneiden Blöcke von frischem Hirngewebe von 300, 500, 1000, 1500 und 2500 um Dicke in 0-4 ° C ACSF mit einem Vibratom 14. Legen Sie ein Stück Schädel mit einer Kraniotomie identisch mit der in lebenden Mäusen unter der LED durchgeführt. Zunächst messen die Lichtleistung ohne Gewebe auf LED zentriert. Legen Sie dann jeden Block von Gewebe zwischen den LED und dem Photodetektor des Leistungsmesser, und messen die Kraft. Erstellen Sie eine Kurve der Gewebedicke gegenüber der relativen Übertragung Fraktion, als das Verhältnis berechnetzwischen der Macht durch das Gewebe und ohne Gewebe gemessen.
- Anesthetize eine Maus mit 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin, in steriler Kochsalzlösung verdünnt. Reinigen und desinfizieren Sie die LED mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Haare aus der Kopfhaut des Tieres und desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei Anwendungen von Wechselstrom 70% Ethanol und betadine. Dann legen Sie das Tier in den stereotaktischen Rahmen. Übernehmen Augensalbe zu verhindern Austrocknen der Hornhaut. Befestigen Sie die Sendeeinheit einen stereotaktischen Halter. Die Position der Nase bar sollte so eingestellt, bis die Oberfläche des Schädels über den Riechkolben ist perfekt horizontal und parallel zur Oberfläche der Miniatur-LED sein.
- Mit einem Skalpell, schneiden Sie die Kopfhaut von 3 mm vor den Augen bis 3 mm hinter den Ohren. Ziehen Sie die Haut beiseite und verankern mit einem Paar Klammern. Kratzen entfernt die Membranen an der Oberfläche des Schädels mit einer Rasierklinge. Reinigen und trocknen Sie den Schädel. Tragen Sie eine dünne Abdeckung des Cyanacrylat-Klebstoff auf nachfolgende ad ermöglichenmenhalt der zahnärztlichen Acryl.
- Mit einem High-Speed-chirurgische Bohrer, führen Sie einen rechteckigen Kraniotomie (1 mm und 3 mm kaudal lateral; zentriert auf 5,1 mm caudal, 0 mm lateral vom Bregma) über den Riechkolben. Um dies zu tun, sorgfältig dünnen Schädel, bis nur noch eine dünne Schicht des Knochens bleibt. Entfernen Sie vorsichtig die restlichen Knochen mit Hilfe einer gebogenen Kanüle. Besondere Vorsicht ist geboten, um zu vermeiden Punktion der Dura Materie und Bersten der großen Blutgefäße, die zwischen den beiden Hemisphären und in die hintere Begrenzung der Riechkolben liegen. Blut Akkumulation und Koagulation bei der Hirnoberfläche schließt optimale Lichteinfall in das Gewebe. Spülen Sie die Kraniotomie und der Oberfläche des Gehirns mit einer sterilen Kochsalzlösung und dann trocknen den Schädel.
- Bringen Sie die Miniatur-LED, um den Anschluss. Senken Sie die Miniatur auf der Oberseite der Riechkolben LED. Die Hauptachse des Miniatur-LED sollte parallel zu den rostral-kaudale Achse der Maus, Clean mit steriler Kochsalzlösung und dry des Schädels. Dann sichern die LED auf den Schädel mit einer ersten Schicht aus Acryl (dh Polycarboxylatzement), gefolgt von einer zweiten Schicht von zahnärztlichen Acryl gefolgt. Die Zugabe von zwei kleinen Schrauben erforderlich, um die LED zu beheben. Die Schrauben sollten auf dem Schädel eingefügt werden (hinter der LED-Position) und mit beiden Acryl. Während die Acryl noch flüssig ist, zurück zu ziehen und kleben Sie die freien Kanten der Kopfhaut auf der Oberfläche des zahnärztlichen Acryl. Achten Sie darauf, alle Acryl auf den Anschluss beantragen. Nach dem Acryl ausgehärtet ist, entfernen Sie das Tier von stereotaktischen Apparat und lassen Sie es auf eine wärmende Unterlage wieder vor der Rückkehr in Käfig. Die Tiere sind in ihrem Käfig, aus dem Eingriff für mindestens sieben Tage erholen links isoliert. Darüber hinaus können Tiere eine nicht-steroidale entzündungshemmende Schmerzmittel (zB Carprofen 4mg/kg) unmittelbar nach gegeben und 3 Tage nach der Operation. LEDs sollten vor der Implantation und nach Beendigung der Experimente getestet werden.
- Ein leichter elektrischercal-Kabel wird verwendet, um tether das Tier mit einem Stromregler für LED gekoppelt mit einem Impulsgeber (Master-8), um das Timing und die Intensität der LED-Steuerung. Die dünnen Kabel ermöglicht volle Bewegungsfreiheit. Achten Sie auf die Polarität der Stecker achten. Umkehren der Polarität kann brechen die LED.
3. Repräsentative Ergebnisse:
ChR2-YFP ist in transduzierten Neuronen etwa 48 Stunden nach der Injektion zum Ausdruck, und bleibt für mehrere Monate 7 stabil. Abbildung 1 ist ein repräsentatives Bild von einem Sagittalschnitt einer Paraformaldehyd-fixierten Tier 15 Tage nach der Injektion. Beachten Sie die dichten Kennzeichnung und die Größe der Injektionsstelle in das RMS. Eine große Zahl von Neugeborenen Zellen entlang der RMS migriert, die verschiedenen Schichten der Riechkolben (Abb. 1) zu besiedeln. Das Fusionsprotein wird in allen Neuronen Fächer, einschließlich der Soma, Dendriten und Dornen ausgedrückt.
Miniatur-LED IMPLA ntation ermöglicht in großem Maßstab und kostengünstige optische Stimulation von einem breiten Bereich von Interesse. Das Tier ist es, die LED-Controller mit einem leichten elektrischen Kabel, die eine völlige Bewegungsfreiheit ermöglicht angebunden. Mit der Charakterisierung der Lichtstreuung in das Hirngewebe und die Schwelle von ChR2 Aktivierung, schätzen wir, dass die optische Aktivierung in einer Tiefe von ~ 2 mm unterhalb der Oberfläche der LED (Abb. 2A) ausgelöst werden könnten. Zur Überwachung der funktionellen Aktivierung von ChR2-exprimierenden Neuronen in vivo, kann die Expression von c-fos, einem Marker der neuronalen Aktivität, nach wiederholtem Licht-Stimulation (Abb. 2B) analysiert werden. Als Alternative, können in vitro elektrophysiologische Ableitungen von ChR2-exprimierenden Neuronen gekoppelt fokalen Licht Stimulation 14 durchgeführt werden. Schließlich haben Zwei-Photonen gezielt loose-Patch-Aufnahmen verwendet worden, um die funktionelle Aktivierung von ChR2-exprimierenden kortikalen Neuronen durch ähnliche Miniatur in vivo 9 LED studieren.
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Abbildung 1. ChR2-YFP Ausdruck von lentiviralen Injektion in den rostralen wandernde Bach. Representative konfokalen Bildern einer saggital Abschnitte der Riechkolben der Maus 15 Tage nach den Injektionen der ein Lentivirus im rostralen RMS. Beachten Sie die Anwesenheit von zerstreuten YFP neugeborenen Neuronen Migration von Ende der RMS, die verschiedenen Schichten der OB. Die meisten Neugeborenen-Zellen (95%) sind Körnerzellen, die Soma liegen in der Körnerzellschicht (GCL) und Dendriten verzweigen in die externe Plexiform Layer (EPL). Eine kleine Population von neugeborenen Neuronen wandern bis zu den oberflächlichen Schichten des OB, in der glomerulären Layer (GL). Scale-bar, 100 um. Inset, hoher Vergrößerung eines neugeborenen Körnerzellen, welche die Membran Ausdruck ChR2-YFP in den Dendriten als auch in Dornen. Scale-bar, 20 um.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der implantierten LED auf der Oberseite der Riechkolben und Licht-evozierte c-fos-Expression in ChR2-YFP exprimieren neuen Körnerzellen.
A, Schematische Darstellung des implantierten über den Riechkolben LED.
B, Vertreter konfokalen Bildern zeigt Doppel-markierten ChR2-YFP + c-fos + Körnerzellen eine Stunde nach Licht Stimulation der Riechkolben. C-fos-Expression offenbart mit einem Kaninchen-anti-c-fos primärer Antikörper (Calbiochem, 1:5000) und A568-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Invitrogen, 1:1000). Scale-bar, 10 um.
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Discussion
Optogenetische Werkzeuge haben vor kurzem unsere Kontrolle über selektive neuronale Populationen, einschließlich der Erwachsenenbildung geboren Neuronen im olfaktorischen System erhöht. Hier beschreiben wir, wie Sie eine stereotaktische Injektion eines lentiviralen Vektor, ChR2-YFP in einer bestimmten Population von Erwachsenen geboren Neuronen führen. Durch die sorgfältige Überwachung der Zeit nach der Injektion, sind wir in der Lage zu analysieren und zu manipulieren, die Aktivität von einer Kohorte von Erwachsenen geboren Neuronen mit einer relativ homogenen Alters.
Aufgrund ihrer geringen Verbreitung Verbreitung, ihrer hohen Transduktionseffizienz und ihre relative gute Tropismus für Neuroblasten der RMS, sollte lentiviralen Vektoren im Vergleich zu anderen viralen Vektoren wie Retroviren oder Adeno-assoziierte Viren (AAV) begünstigt werden. Weil sie infizieren selektiv teilenden Zellen, wie z. B. Stammzellen oder Vorläuferzellen, müssen Retrovirus-Vektoren in der Subventrikularzone injiziert werden und transduzieren eine kleinere Population von neugeborenen Neuronen. Im Vergleich zu lentiviralen vektoren bieten AAV-Vektoren eine deutlich höhere Ausbreitung der Infektion. Allerdings sollte AAV Transduktion von Neuroblasten in der RMS wegen der Transduktion von umgebenden Strukturen wie die akzessorischen olfaktorischen Kern, einer Region, die Projekte Axone zurück in den Riechkolben vermieden werden. Schließlich implantierter LEDs verwenden können, um anderen oberflächlichen Strukturen des Gehirns wie kortikale Regionen, in denen ChR2 Ausdruck in spezifischen Populationen von Neuronen durch virale Vektoren oder über eine transgene Maus Linie 10 gefahren ist aufgebracht werden.
Mit LED-Implantation, sind wir in der Lage, chronische optische Stimulation die funktionelle Rolle der Riechkolben adulte Neurogenese in wach verhaltenden Tier-Studie gelten. Diese einfache Lichtquelle bietet eine schnelle zeitliche Steuerung von Licht durch die intrinsisch schnellen on / off Geschwindigkeit von LEDs. Neben der kostengünstigen, erzeugt eine Miniatur-LED-Lichtquelle ausreichend Leistung (~ 100mW) für ChR2 Aktivierung in einem großen Volumen des GehirnsGewebe 11, auch bilateral im Falle der Riechkolben. Dies ist besonders wichtig in dieser Hirnregion, in denen erhebliche Veränderungen ohne Auswirkungen auf die Geruchs-Qualität Wahrnehmung durch ein hohes Maß an Redundanz in die Eingänge aus dem Riechepithel 12 sein kann. Dank seiner Leistung und seiner spektralen Bandbreite (25nm), so kann diese Miniatur-LEDs für Licht-evozierte Anregung mit ChR2 sowie andere Versionen von Channelrhodopsine wie Cheta oder Catch verwendet werden. Miniatur-gelb (597nm) und rot (624 oder 637nm) LEDs stehen für rotverschoben Rhodopsine wie Halorhodopsin und VChR1 13 verwendet werden.
Miniatur-LEDs zeigen auch Grenzen. Zur Vermeidung von Erwärmung des Gehirns, muss ein Kompromiss zwischen Pulsdauer, Pulsfrequenz und Lichtintensität gefunden werden. Zum Beispiel sind kurze Lichtpulse von 5 Millisekunden bei hohen Frequenzen (> 20Hz) und der Lichtintensität von 100 mW empfohlen. Oberhalb dieser Laufzeit ein significant Erhöhung der Temperatur (~ 1-4 ° C) in das umliegende Gewebe gemessen werden kann. Dieser Parameter sollte bei längeren Lichtimpulsen (> 5 ms) oder Dauerlicht Stimulation genommen werden, insbesondere im Falle von Licht-evozierte Hyperpolarisation mit Halorhodopsin. Darüber hinaus bietet die aktuelle Versorgung der LED starken elektrischen Artefakt, das in vivo elektrophysiologischen Ableitungen ausschließen kann, wenn die LED in direktem Kontakt mit dem Gewebe. Laser-gekoppelten optischen Fasern bilden eine mögliche Alternative, so dass eine kleinere und mehr eingeschränkt optische Stimulation. Allerdings kann die Steifigkeit des optischen Fasern mit bestimmten Verhaltensweisen stören.
Nach der Charakterisierung der Lichteinfall und die funktionelle Stimulation von Neuronen durch Licht, kann in vivo optische Stimulation in Kombination mit einer Verhaltenstherapie Experimente ausgelöst werden. Besondere Vorsicht ist in Bezug auf den Zeitpunkt der Stimulation genommen werden. Die Synchronisation der photostimunung mit einem bestimmten Verhalten oder einer Aufgabe in einem Verhaltens-Apparat, vor allem während der operante Konditionierung, könnte entscheidend sein für die Errichtung eines ursächlichen Zusammenhangs zwischen Zell-Aktivierung und Verhalten.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Versicherungsgesellschaft "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), die Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" im Rahmen des "ERA-NET NEURON" der unterstützten RP7-Programm von der Europäischen Kommission, "Foundation pour la Recherche Medicale", die Letten-Stiftung und der Pasteur-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
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