Summary
I neuroni adulti, nato del bulbo olfattivo può essere controllato tramite optogenetically Channelrhodopsin2 che esprimono iniezione lentivirali nel flusso migratorio rostrale e fotostimolazione cronica con una miniatura impiantato LED.
Abstract
Interneuroni locali sono continuamente rigenerati nel bulbo olfattivo di roditori adulti 1-3. In questo processo, chiamato neurogenesi adulta, le cellule staminali neurali nelle pareti del ventricolo laterale danno luogo a neuroblasti che migrano per diversi millimetri lungo il flusso migratorio rostrale (RMS) per raggiungere e incorporare nel bulbo olfattivo. Per studiare le diverse fasi e l'impatto di adulti nati integrazione dei neuroni preesistenti in circuiti olfattiva, è necessario etichettare in modo selettivo e manipolare l'attività di questa specifica popolazione di neuroni. Il recente sviluppo delle tecnologie optogenetic offre l'opportunità di usare la luce per attivare appunto questo gruppo specifico di neuroni senza intaccare i neuroni circostanti 4,5. Qui vi presentiamo una serie di procedure per viralmente esprimere Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP in una coorte temporalmente ristretto di neuroblasti in RMS prima di raggiungere il bulbo olfattivo e diventare adulto-nato neurons. Inoltre, ci mostrano come impianto e calibrare una miniatura a LED per la stimolazione cronica in vivo di ChR2-esprimere i neuroni.
Protocol
1. Stereotassica iniezioni
- Il virus usato in questi esperimenti è una replica con deficit di vettori lentivirali basati sul virus HIV per esprimere Channelrhodopsine2-YFP (gialla proteina fluorescente) fusione costruire guidata da un promotore sinapsina 6. Il plasmide è stato generosamente forniti da K. Deisseroth 's di ricerca del gruppo ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentivirus possono essere ottenute da fonti commerciali o prodotti in laboratorio secondo i protocolli stabiliti 7. I titoli vettore media sono stati nell'ordine di 10 10 unità di trasduzione / ml. Aliquote virali sono conservati a -80 ° C e deve essere scongelato poco prima del caricamento della pipetta. Molteplici cicli gelo / disgelo dovrebbe essere evitato. Mai esposizione la soluzione virus direttamente al ghiaccio secco.
- Preparare pipette in vetro con vetro borosilicato capillari su standard estrattore pipetta (Sutter P-97 Pipetta estrattore). L'impostazione della trazione dovrebbe essere correttamente calibrato per produrre una pipetta lunga e rigida. Quindi, tagliare la punta della pipetta con un paio di forbici per ottenere una punta di 30-40 micron di diametro. Conservare tirato pipette in una scatola di polvere.
- Impostare il Nanoject II microinjector con le istruzioni del produttore per la consegna di 50 nL. Preparare la pipetta da iniezione di back-riempimento con olio minerale e inserirla per lo stantuffo microinjector. Attaccare il microinjector su un telaio stereotassico. Olio parzialmente vuote dalla pipetta di vetro prima di riempire con la soluzione antivirus
- Con una micropipetta, trasferire 2 ml di soluzione di virus su un pezzo sterile di Parafilm. Abbassare delicatamente la pipetta di vetro nella goccia di soluzione di virus e riempire la pipetta con 1-2 microlitri. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella pipetta.
- Anestetizzare un mouse con 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina, diluito in soluzione fisiologica sterile. Togliere i capelli dal cuoio capelluto delanimali con tagliaunghie roditore, rasoi, forbici, o depilitory agente chimico. Disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni di alternare al 70% etanolo e Betadine. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave e poi disinfettata con etanolo al 70%. Posto l'animale nel telaio stereotassico con barre orecchio e naso bar, assicurando che la testa è sicuro. Applicare una pomata oculare per evitare l'essiccazione delle cornee.
- Con un bisturi, tagliare il cuoio capelluto da in mezzo agli occhi a tra le orecchie. Tirare la pelle da parte per esporre il cranio e la pelle ancora con un paio di pinze. Pulire la superficie del cranio. L'apparato stereotassico viene azzerato con la punta della pipetta di vetro al bregma. Poi la punta è posizionata nel sito di iniezione (antero-posteriore, 3,30; medio-laterale, ± 0,82, per entrambi gli emisferi destro e sinistro, rispettivamente). La posizione della barra naso deve essere regolata in base al calcolo delle coordinate stereotassica. Nel nostro esperimento, il bar naso è regolata uino bregma e il sito di iniezione sono allineati alla stessa altezza.
- Identificare il sito di iniezione. Utilizzando un trapano ad alta velocità chirurgica, accuratamente praticare dei fori nel cranio. Con un ago da siringa piegato agganciato alla punta, rimuovere i resti di ossa fino ad esporre la dura madre. Controllare che il foro sia centrato nella posizione corretta. Fare attenzione a non vasi sanguigni rottura sulla superficie del cervello durante la perforazione. Se i vasi sanguigni sono rotti, premere delicatamente sulla superficie del cervello con un cotton fioc di piccole dimensioni o tessuto per alcuni secondi fino a quando il flusso di sangue si ferma.
- Abbassare la pipetta e zero il dorso-ventrale altezza quando la punta della pipetta tocca la superficie del cervello. Quindi, abbassare al corretto dorso-ventrale profondità (dorso-ventrale, 2,9 dalla superficie del cervello) e attendere 30 secondi per l'equilibrio della pressione. Iniettare 4 volte 50 nl di virus per un totale di 200 nl. Attendere 30 secondi tra ogni iniezione.
- Un minuto dopo l'ultima iniezione, ritirare lentamente il tubotte. Ripetere 1,6-1,8 punti per l'altro emisfero. Rimuovere l'animale da un apparecchio stereotassico, pulire l'incisione e cucire la pelle tagliata con filo chirurgico. Permettere agli animali di recuperare sul pad il riscaldamento prima di tornare in gabbia. Inoltre, gli animali può essere data una non-steroidei anti-infiammatori analgesico (ad esempio, Carprofen 4mg/kg) subito dopo e 3 giorni dopo l'intervento.
2. Cronico impianto a LED per la stimolazione optogenetic vivo nel bulbo olfattivo
- Gli animali iniettati con particelle lentivirali bilateralmente sono accanto cronicamente impiantati con un LED blu in miniatura (Osram, LED blu CMS 4.6W). Saldare i pin LED per una femmina connettore elettrico in miniatura in modo che il connettore è posizionato sul lato opposto del LED. Controllare che non ci sia tagliato corto elettrico e di individuare il perno positivi e negativi sul connettore. Prova il LED collegandolo ad un regolatore di corrente per LED anche se un cavo adatto.
- Per misurare e / o impostare il potere assoluto della luce del LED, montare il LED su un micromanipolatore e posizionare il LED in contatto diretto con il fotorilevatore di un misuratore di potenza di picco di intensità della luce a 470 nm. Praticare un foro di 3 mm di diametro in un bordo in PVC opaco. Apporre questo foro stenopeico al misuratore di potenza e costruire una curva standard di potenza ottica contro corrente di ingresso per il calcolo della potenza per mm 2.
- Per misurare la propagazione della luce attraverso il cervello, tagliare i blocchi di tessuto cerebrale fresco di 300, 500, 1000, 1500 e 2500 micron di spessore 0-4 ° C ACSF utilizzando un vibratome 14. Posizionare un pezzo di cranio con una craniotomia identico a quello effettuato nei topi vivono sotto il LED. In primo luogo, misurare la potenza luminosa senza tessuto centrata su LED. Poi, luogo ogni blocco di tessuto tra i LED e il fotodetettore del misuratore di potenza, e misurare la potenza. Costruire una curva di spessore dei tessuti contro frazione di trasmissione relativa, calcolato come rapportotra la potenza misurata attraverso il tessuto e senza tessuto.
- Anestetizzare un mouse con 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina, diluito in soluzione fisiologica sterile. Pulire e disinfettare il LED con il 70% di etanolo. Togliere i capelli dal cuoio capelluto dell'animale e disinfettare il cuoio capelluto con tre applicazioni di alternare al 70% etanolo e Betadine. Poi posto l'animale nel frame stereotassico. Applicare una pomata oculare per evitare l'essiccazione delle cornee. Collegare il connettore al titolare stereotassico. La posizione della barra di naso dovrebbe essere regolata fino a quando la superficie del cranio sopra il bulbo olfattivo è perfettamente orizzontale e parallelo alla superficie della miniatura LED.
- Con un bisturi, tagliare il cuoio capelluto da 3 mm anteriore agli occhi a 3 mm posteriormente alle orecchie. Tirare la pelle da parte e ancorarlo con un paio di pinze. Raschiare le membrane sulla superficie del cranio con una lama di rasoio. Pulire e asciugare il cranio. Applicare una copertura sottile di collante cianoacrilato per consentire ad successivehesion di acrilico dentale.
- Utilizzando un trapano ad alta velocità chirurgico, eseguire una craniotomia rettangolare (1 mm e 3 mm caudale laterale; centrata sulla caudale millimetri 5,1, 0 mm laterale da bregma) il bulbo olfattivo. Per fare questo, con attenzione sottile il cranio fino a solo un sottile strato di resti ossei. Rimuovere con cautela l'osso residuo, con l'aiuto di un ago della siringa piegato. Particolare cura deve essere adottate per evitare la puntura della dura madre e la rottura dei vasi sanguigni principali che si trovano tra i due emisferi e nel bordo caudale dei bulbi olfattivi. L'accumulo e la coagulazione del sangue sulla superficie del cervello impedisce la penetrazione della luce ottimale nel tessuto. Sciacquare la craniotomia e la superficie del cervello con soluzione salina sterile e poi asciugare il cranio.
- Fissare la miniatura LED al connettore. Abbassare la miniatura LED sulla parte superiore dei bulbi olfattivi. L'asse principale della miniatura LED dovrebbe essere parallela alla rostrale-caudale asse del mouse, pulito con soluzione salina sterile e dry del cranio. Quindi fissare il LED al cranio con un primo strato di acrilico (cioè, cemento policarbossilato), seguita da un secondo strato di acrilico dentale. L'aggiunta di due piccole viti possono essere necessari per risolvere il LED. Le viti devono essere inserite sul cranio (posteriore nella posizione a LED) e coperto con entrambe acrilici. Mentre l'acrilico è ancora liquido, tirare indietro e colla i bordi liberi del cuoio capelluto sulla superficie della acrilico dentale. Fate attenzione a non applicare alcuna acrilico sul connettore. Dopo l'acrilico è indurito, rimuovere l'animale da un apparecchio stereotassico e farlo recuperare su un blocco del riscaldamento prima di tornare in gabbia. Gli animali sono rimasti isolati nella loro gabbia per recuperare da un intervento chirurgico per almeno sette giorni. Inoltre, gli animali può essere data una non-steroidei anti-infiammatori analgesico (ad esempio, Carprofen 4mg/kg) subito dopo e 3 giorni dopo l'intervento. I LED dovrebbero essere testati prima dell'impianto e dopo il termine degli esperimenti.
- Una luce eletcal cavo è usato per legare l'animale ad un regolatore di corrente per LED accoppiato ad un generatore di impulsi (Master-8) di controllare i tempi e l'intensità dei LED. Il cavo sottile consente la completa libertà di movimento. Fare attenzione a rispettare la polarità del connettore. Invertendo la polarità può rompere il LED.
3. Rappresentante dei risultati:
ChR2-YFP è espresso in trasdotte neuroni circa 48 ore dopo l'iniezione, e rimane stabile per diversi mesi 7. La figura 1 è un quadro rappresentativo di una sezione sagittale del paraformaldeide-fisso animali 15 giorni dopo l'iniezione. Si noti l'etichettatura denso e le dimensioni del sito di iniezione in RMS. Un gran numero di cellule neonato sono migrate lungo la RMS a colonizzare i vari strati del bulbo olfattivo (Fig. 1). La proteina di fusione è espresso in tutti i comparti neurone, tra cui il soma, dendriti e spine.
In miniatura LED impla ntation permette di grandi dimensioni e poco costoso stimolazione ottica di una vasta regione di interesse. L'animale è legato al controller LED con un cavo della luce elettrica che permette una completa libertà di movimento. Caratterizzando la diffusione della luce nel tessuto cerebrale e la soglia di attivazione ChR2, stimiamo che l'attivazione ottico potrebbe essere innescato ad una profondità di circa due millimetri sotto la superficie del LED (Fig. 2A). Per monitorare l'attivazione funzionale di ChR2-esprimere i neuroni in vivo, l'espressione del c-fos, un marker di attività neuronale, possono essere analizzati dopo stimolazione luminosa ripetitiva (Fig. 2B). In alternativa, nelle registrazioni elettrofisiologiche in vitro di neuroni che esprimono ChR2 accoppiato a stimolazione luminosa focale può essere effettuata 14. Infine, a due fotoni mirati loose-patch registrazioni sono state utilizzate per studiare l'attivazione funzionale di ChR2-esprimere i neuroni corticali da miniatura simili a LED in vivo 9.
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Figura 1. ChR2-YFP espressione da iniezione lentivirale nel flusso migratorio rostrale. Immagini confocale rappresentante di una sezione sagittale del bulbo olfattivo di un topo 15 giorni dopo iniezioni di un lentivirus nel rostrale RMS. Si noti la presenza di neuroni sparsi YFP neonato migrazione da fine del RMS per i diversi strati della OB. La maggior parte delle cellule neonato (95%) sono le cellule dei granuli, che si trovano soma nello strato cellulare granuli (GCL) e dendriti arborize nello strato esterno plessiformi (EPL). Una piccola popolazione di neuroni neonati migrare fino allo strato più superficiale della OB, nel livello glomerulare (GL). Scala grafica, 100μm. Incasso, ad alto ingrandimento di una cellula granulo neonato, mostrando l'espressione di membrana ChR2-YFP nella dendriti e in spine. Scala grafica, 20μm.
Figura 2. Schema di impianto a LED sulla parte superiore del bulbo olfattivo e la luce-evocati c-fos espressione ChR2-YFP cellule che esprimono nuovi granuli.
A Schema del LED impiantato al di sopra del bulbo olfattivo.
B, Rappresentante immagini confocale mostrano doppio etichettati ChR2-YFP + c-fos granuli + un'ora dopo stimolazione luminosa del bulbo olfattivo. C-fos espressione è rivelato con un anti-c-fos anticorpo primario di coniglio (Calbiochem, 1:5000) e A568-anti-coniglio coniugato anticorpo secondario (Invitrogen, 1:1000). Scala grafica, 10μm.
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Discussion
Strumenti Optogenetic hanno recentemente aumentato il nostro controllo sulle popolazioni di neuroni selettivi, tra cui i neuroni adulti nati nel sistema olfattivo. Qui si descrivono come eseguire una iniezione stereotassica di un vettore lentivirus che esprimono ChR2-YFP in una specifica popolazione di adulti nati neuroni. Con un attento monitoraggio del periodo post-iniezione, siamo in grado di analizzare e manipolare l'attività di una coorte di adulti nati i neuroni con un età relativa omogenea.
A causa della loro diffusione diffusione bassa, la loro elevata efficienza di trasduzione e il loro tropismo relativa buona per neuroblasti del RMS, vettori lentivirali dovrebbe essere favorito rispetto ad altri vettori virali come retrovirus o virus adeno-associati (AAV). Perché selettivamente infettare cellule in divisione, come le cellule staminali o progenitrici, vettori retrovirus deve essere iniettato nella zona subventricolare e trasdurre una popolazione minore di neuroni neonati. Rispetto al lentivirali vSETTORI, vettori AAV fornire una diffusione molto più alta di infezione. Tuttavia, trasduzione AAV di neuroblasti in RMS dovrebbe essere evitata a causa della trasduzione delle strutture circostanti, come il nucleo olfattivo accessorio, una regione che i progetti assoni nel bulbo olfattivo. Infine, l'uso di LED impiantato può essere applicato ad altre strutture superficiali del cervello, come le regioni corticali in cui è guidato ChR2 espressione in specifiche popolazioni di neuroni attraverso vettori virali o tramite una linea di topi transgenici 10.
Con l'impianto a LED, siamo in grado di applicare cronica stimolazione ottica per studiare il ruolo funzionale della neurogenesi nel bulbo olfattivo adulto sveglio animali comportarsi. Questa fonte di luce semplice fornisce un controllo veloce temporale di luce grazie alla intrinsecamente rapido on / off velocità di LED. Oltre ad essere poco costoso, una sorgente luminosa a LED in miniatura produce energia sufficiente (~ 100 mW) per l'attivazione ChR2 in un grande volume di cervellotessuto 11, anche bilateralmente, nel caso di bulbi olfattivi. Ciò è particolarmente importante in questa regione del cervello dove le lesioni significative possono essere senza effetto sulla percezione degli odori di qualità a causa di un alto grado di ridondanza degli ingressi dai 12 epitelio olfattivo. Grazie alla sua potenza e la sua larghezza di banda spettrale (25nm), questi LED in miniatura possono essere utilizzati per la luce-eccitazione evocati utilizzando ChR2 così come le altre versioni di channelrhodopsins come CHETA o prendere. Miniatura giallo (597nm) e rosso (624 o 637nm) LED sono disponibili per essere utilizzate per il rosso in differita rhodopsins come halorhodopsin e VChR1 13.
I LED in miniatura mostrano anche i limiti. Per evitare il riscaldamento del cervello, un compromesso deve essere trovato tra durata dell'impulso, frequenza degli impulsi, e l'intensità della luce. Per esempio, impulsi di luce a corto di 5 millisecondi sono consigliate a frequenze elevate (> 20 Hz) e l'intensità luminosa di 100 mW. Sopra di questa durata, una quantità significativaelevazione formica della temperatura (~ 1-4 ° C) nel tessuto circostante può essere misurata. Questo parametro dovrebbe essere preso in considerazione per più impulsi di luce (> 5 ms) o stimolazione luminosa continua, in particolare nel caso della luce evocati iperpolarizzazione con halorhodopsin. Inoltre, la corrente che alimenta il LED fornisce una forte artefatto elettrico, che può precludere in vivo, registrazioni elettrofisiologiche, quando il LED è a diretto contatto con il tessuto. Laser accoppiato in fibra ottica costituiscono una possibile alternativa, che permette una stimolazione più piccolo e più ristretta ottica. Tuttavia, la rigidità delle fibre ottiche possono interferire con determinati comportamenti.
Dopo che caratterizzano la penetrazione della luce e la stimolazione funzionale dei neuroni dalla luce, in vivo stimolazione ottica può essere attivato in combinazione con esperimenti comportamentali. Particolare cura deve essere presa in merito al momento della stimolazione. Sincronizzazione dei photostimumento con uno specifico comportamento o un'attività in un apparato comportamentale, in particolare durante il condizionamento operante, potrebbe essere decisivo per stabilire un nesso causale tra l'attivazione delle cellule e il comportamento.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla compagnia di assicurazione sulla vita "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurosciences de Paris (PEV), l'Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-Neur-004", nella cornice di "NEURON ERA-NET" di 7 ° PQ dalla Commissione Europea, "Fondazione pour la Recherche Medicale", la Fondazione Letten e la Fondazione Pasteur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
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