Summary
Voksen-fødte nevroner i luktelappen kan optogenetically styres ved hjelp Channelrhodopsin2-uttrykke lentiviral injeksjon i rostral vandrende bekken og kronisk photostimulation med en implantert miniatyr LED.
Abstract
Lokale interneurons kontinuerlig regenereres i luktelappen hos voksne gnagere 1-3. I denne prosessen kalles voksen neurogenesis, nevrale stamceller i veggene i den laterale ventrikkelen gi opphav til neuroblasts som vandrer for flere millimeter langs rostral vandrende stream (RMS) for å nå og innlemme i luktelappen. Å studere de ulike trinnene og virkningen av voksen-født neuron integrering i preexisting olfactory kretser, er det nødvendig å selektivt etiketten og manipulere aktiviteten av denne bestemte befolkning av nerveceller. Den siste tidens utvikling av optogenetic teknologier gir muligheten til å bruke lys til å nettopp aktivere denne spesifikke kohort av nerveceller uten å påvirke omkringliggende nerveceller 4,5. Her presenterer vi en rekke prosedyrer for å virally uttrykke Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP i en timelig begrenset kohort av neuroblasts i RMS før de når luktelappen og bli voksen-født neurons. I tillegg viser vi hvordan implantatet og kalibrere en miniatyr LED for kronisk in vivo stimulering av ChR2-uttrykke nevroner.
Protocol
1. Stereotaxic injeksjoner
- Viruset som brukes i disse forsøkene er en replikering-mangelfull lentiviral vektor basert på HIV-viruset å uttrykke Channelrhodopsine2-YFP (gule fluorescerende protein) fusion konstruere drevet av en synapsin promoter 6. Plasmidet ble sjenerøst gitt av K. Deisseroth 's forskergruppe ( http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentiviruses kan fås fra kommersielle kilder eller produsert i laboratoriet i henhold til etablerte protokoller 7. Gjennomsnittlig vektor titere var i størrelsesorden 10 10 transduksjon enheter / ml. Viral alikvoter lagres ved -80 ° C og bør tines like før pipette lasting. Flere fryse / tine sykluser bør unngås. Aldri eksponering viruset løsningen direkte til tørris.
- Forbered glass pipetter bruker borsilikatglass kapillærer på standard pipette puller (Sutter P-97 Pipette puller). Den trekker innstillingen skal være riktig kalibrert for å gi en lang og stiv pipette. Deretter skjærer tuppen av pipetten ved hjelp av en saks for å få et tips på 30-40 mikrometer i diameter. Oppbevar dro pipetter i en støvfri boks.
- Oppsett av Nanoject II microinjector med produsentens anvisninger for levering av 50 nL. Klargjør injeksjon pipetteres med back-fylling med mineralolje og sett det inn til microinjector stempelet. Fest microinjector på en stereotaxic ramme. Delvis tomme olje fra glasset pipetten før du fyller med viruset løsningen
- Med en mikropipette, overføring 2 mL av virus løsning på en steril stykke Parafilm. Senk forsiktig glasset pipetten inn i dråpe virus løsning og fyll pipette med 1-2 mL. Pass på at det ikke er luftbobler i pipetten.
- Anesthetize en mus med 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin, fortynnet i sterilt saltvann. Fjern hår fra hodebunnen avdyret bruker gnager clippers, barberhøvel, saks, eller kjemiske depilitory agent. Desinfiser hodebunnen med tre anvendelser av vekslende 70% etanol og betadine. Alle kirurgiske instrumenter bør også autoklaveres og deretter desinfisert med 70% etanol. Plasser dyret i stereotaxic rammen med øre barer og nese bar, sikre at hodet er sikker. Påfør øye salve for å hindre uttørking av hornhinner.
- Med en skalpell, kutt i hodebunnen fra mellom øynene til mellom ørene. Dra huden til side for å avsløre skallen og anker huden med et par klemmer. Rengjør overflaten av skallen. Den stereotaxic Apparatet er zeroed med spissen av glass pipetten på bregma. Deretter spissen er plassert på injeksjonsstedet (Antero-posterior, 3,30, Medio-Lateral, ± 0.82, for både høyre og venstre hjernehalvdel, henholdsvis). Plasseringen av nesa bar må justeres i henhold til beregningen av stereotaxic koordinater. I vårt eksperiment, er nesen bar justeres until bregma og injeksjonsstedet er justert i forhold til samme høyde.
- Identifiser injeksjonsstedet. Ved hjelp av en høyhastighets kirurgisk drill, nøye bore hull inn i skallen. Med et bøyd sprøytespissen hektet på spissen, fjerne restene av tynne bein å avsløre dura mater. Kontroller at hullet er sentrert i riktig posisjon. Pass på ikke å sprekke blodkar på overflaten av hjernen under boringen. Hvis blodårene er sprukket, forsiktig trykk på overflaten av hjernen med en liten bomullspinne eller vev i flere sekunder til blodstrømmen stopper.
- Senk pipette og null i Dorso-Ventral høyde når tuppen av pipetten berører overflaten av hjernen. Deretter lavere til riktig Dorso-Ventral dybde (Dorso-Ventral, 2,9 fra hjernen overflate) og vent 30 sekunder for press likevekt. Injiser 4 ganger 50 nl virus for totalt 200 nl. Vent 30 sekunder mellom hver injeksjon.
- Ett minutt etter siste injeksjon, sakte trekke røretTTE. Gjenta punkt 1.6 til 1.8 for den andre halvkule. Ta dyret fra stereotaxic apparater, rene snitt og sy kuttet huden ved hjelp av kirurgisk tråder. La dyret å komme seg på oppvarming pad før retur til buret. I tillegg kan dyr bli gitt et ikke-steroide anti-inflammatoriske smertestillende (f.eks carprofen 4mg/kg) umiddelbart etter og tre dager etter operasjonen.
2. Kronisk LED implantasjon for in vivo optogenetic stimulering i luktelappen
- Dyr injisert med lentiviral partikler bilateralt er neste kronisk implantert med en miniatyr blå LED (Osram, LED CMS 4.6W blå). Loddetinn LED pins til en kvinnelig miniatyr elektrisk kontakt slik at kontakten er plassert på motsatt side av LED. Sjekk at det ikke er elektrisk snarvei og identifisere de positive og negative pin på kontakten. Test av LED ved å koble den til en nåværende kontroller for LED om en skikkelig kabel.
- Å måle og / eller sette absolutte lys makt LED, monterer LED på en micromanipulator og posisjon LED i direkte kontakt med fotodetektoren av en kraftmåler av en topp lysintensitet på 470 nm. Bor et pinhole av 3 mm diameter i en ugjennomsiktig PVC bord. Feste dette pinhole til strømmåleren og bygge en standardkurve av optisk effekt versus inngangsstrømmen å beregne kraften per mm 2.
- For å måle utbredelsen av lys gjennom hjernen, klippe blokker av fersk hjernevev på 300, 500, 1000, 1500 og 2500 mikrometer tykkelse på 0-4 ° C ACSF med en vibratome 14. Plasser en bit av skallen med en kraniotomi identisk med den fremført i levende mus under LED. Først måle lyset strøm uten vev sentrert på LED. Deretter plasserer hver blokk av vev mellom LED og fotodetektoren av strømmåleren, og måle makt. Bygg en kurve av vev tykkelsen versus relativ overføring brøkdel, beregnet som forholdetmellom makt måles gjennom vev og uten vev.
- Anesthetize en mus med 100 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin, fortynnet i sterilt saltvann. Rengjør og desinfiser LED med 70% etanol. Fjern hår fra hodebunnen av dyret og desinfiser hodebunnen med tre anvendelser av vekslende 70% etanol og betadine. Deretter plasserer dyret i stereotaxic rammen. Påfør øye salve for å hindre uttørking av hornhinner. Fest kontakten til en stereotaxic holderen. Plasseringen av nesa bar bør justeres inntil overflaten av skallen over luktelappen er helt horisontalt og parallelt med overflaten av miniatyr LED.
- Med en skalpell, kutt i hodebunnen fra 3 mm anterior for øynene til 3 mm posteriort for ørene. Dra huden til side og forankre det med et par klemmer. Skrap bort membraner på overflaten av hodeskallen med et barberblad. Rengjør og tørk skallen. Påfør et tynt dekke av cyanoakrylater lim for å tillate etterfølgende adhesion of dental akryl.
- Ved hjelp av en høyhastighets kirurgisk drill, utføre en rektangulær kraniotomi (1 mm caudal og 3 mm lateral; sentrert på 5,1 mm caudal, 0 mm lateral fra bregma) over olfactory pærer. For å gjøre dette, nøye tynne skallen til bare et tynt lag av bein gjenstår. Fjern forsiktig gjenværende bein med hjelp av en bøyd sprøytespissen. Spesiell forsiktighet bør utvises for å unngå punktering av dura saken og rupturing de store blodårene som ligger mellom de to halvkuler og i caudal grensen til olfactory pærer. Blood akkumulering og koagulasjon på hjernens overflate utelukker optimal lys trenger inn i vevet. Skyll kraniotomi og overflaten av hjernen med sterilt saltvann og tørk skallen.
- Fest miniatyr LED til kontakten. Senk miniatyr LED på toppen av olfactory pærer. Den viktigste aksen av miniatyr LED bør være parallell med rostral-caudal aksen av musen, Clean med sterilt saltvann og dry skallen. Så sikre LED til skallen med et første lag av akryl (dvs. polycarboxylate sement), etterfulgt av en andre lag av dental akryl. Tilsetting av to små skruer kan være nødvendig å fikse LED. Skruene skal settes inn på skallen (posterior til LED posisjon) og dekket med både akryl. Mens akryl fortsatt er flytende, trekk tilbake og lim den frie kanter av hodebunnen på overflaten av dental akryl. Pass på ikke å påføre noen akryl på kontakten. Etter at akryl har herdet, fjerne dyret fra stereotaxic apparater og la det igjen på en oppvarming puten før vi returnerer til buret. Dyr er igjen isolert i sine bur å gjenopprette fra kirurgi i minst sju dager. I tillegg kan dyr bli gitt et ikke-steroide anti-inflammatoriske smertestillende (f.eks carprofen 4mg/kg) umiddelbart etter og tre dager etter operasjonen. LED bør testes før implantasjon og etter opphør forsøkene.
- Et lys elektriskeCAL-kabel brukes til å tjore dyret til en nåværende kontroller for LED koblet til en pulsgenerator (Master-8) til å kontrollere timing og intensitet av LED. Den tynne kabel gir fullstendig bevegelsesfrihet. Pass på å respektere polaritet av kontakten. Invertere polaritet kan bryte LED.
3. Representant Resultater:
ChR2-YFP er uttrykt i transduced nevroner cirka 48 timer etter injeksjonen, og forblir stabilt i flere måneder 7. Figur 1 er et representativt bilde av en sagittal del av en Paraformaldehyde-fast animalsk 15 dager etter injeksjon. Merk den tette merking og størrelsen på injeksjonsstedet i RMS. Et stort antall nyfødte celler har migrert langs RMS å kolonisere de forskjellige lag av luktelappen (Fig. 1). Den fusion protein uttrykkes i alle nevroner avdelinger, inkludert soma, dendritter, og pigger.
Miniatyr LED impla ntation muliggjør storskala og rimelig optisk stimulering av et bredt område av interesse. Dyret er tjoret til LED-kontroller med en lys elektrisk kabel som gjør at en fullstendig bevegelsesfrihet. Ved å karakterisere lyset diffusjon i hjernevev og terskelen ChR2 aktivering, anslår vi at optisk aktivering kunne bli utløst ved en dybde på ca 2mm under overflaten av LED (fig. 2A). Å overvåke funksjonelle aktivering av ChR2-uttrykke nevroner in vivo, kan uttrykket av c-FOS, en markør av neuronal aktivitet, blir analysert etter repeterende lys stimulering (Fig. 2B). Som et alternativ, kan in vitro elektrofysiologiske opptak av ChR2-uttrykke nevroner koblet til fokal lys stimulering utføres 14. Endelig, har to-foton målrettet løs-patch opptak blitt brukt til å studere den funksjonelle aktivering av ChR2-uttrykke kortikale nevroner ved lignende miniatyr LED in vivo 9.
ntent ">
Figur 1. ChR2-YFP uttrykk fra lentiviral injeksjon i rostral vandrende stream. Representative confocal bilder av en saggital deler av luktelappen av en mus 15 dager etter injeksjoner av et lentivirus i rostral RMS. Legg merke til tilstedeværelsen av spredt YFP nyfødte nerveceller migrerer fra slutten av RMS til de forskjellige lag av OB. De fleste av nyfødte celler (95%) er granule celler, som Soma ligger i Granule Cell Layer (GCL) og dendritter arborize i Eksterne Plexiform Layer (EPL). En liten bestand av nyfødte nerveceller migrerer opp til de mest overfladiske lag av OB, i glomerulær Layer (GL). Scale bar, 100μm. Innfelte, høy forstørrelse av en nyfødt granule celle, viser membran uttrykk for ChR2-YFP i dendritter så vel som i spines. Scale bar, 20μm.
Figur 2. Diagram av implantert LED på toppen av luktelappen og lys-evoked c-fos uttrykk i ChR2-YFP uttrykker nye granule celler.
A, Skjematisk tegning av den implanterte LED over olfactory pærer.
B, Representative confocal bilder som viser dobbel-merket ChR2-YFP + c-fos + granule celler en time etter lett stimulering av luktelappen. C-FOS uttrykk er avslørt ved hjelp av en kanin anti-c-FOS primære antistoff (Calbiochem, 1:5000) og A568-konjugert anti-kanin sekundært antistoff (Invitrogen, 1:1000). Scale bar, 10μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetic verktøy nylig har økt vår kontroll over selektiv nevronal befolkningen, inkludert voksen født nevroner i luktsystemet. Her beskriver vi hvordan du utfører en stereotaxic injeksjon av en lentiviral vektor uttrykker ChR2-YFP i en bestemt populasjon av voksen-fødte nevroner. Ved å nøye overvåke perioden etter injeksjon, er vi i stand til å analysere og manipulere aktiviteten til en kohort av voksen-fødte nevroner med en relativ homogen alder.
På grunn av deres lave diffusjon spredning, deres høye transduksjon effektivitet og deres relative gode tropisme for neuroblasts av RMS, bør lentiviral vektorer være begunstiget i forhold til andre virale vektorer som retrovirus eller adeno-assosiert virus (AAV). Fordi de selektivt infisere dele celler, slik som stamceller eller stamceller, må retrovirus vektorer injiseres i subventricular sone og transduce en mindre bestand av nyfødte nerveceller. Sammenlignet med lentiviral vectors, AAV vektorer gi en langt større spredning av smitte. Imidlertid bør AAV transduksjon av neuroblasts i RMS unngås på grunn av transduksjon av omkringliggende strukturer som tilbehør olfactory kjernen, en region som prosjekter axons tilbake i luktelappen. Til slutt, bruk av implantert LED kan brukes på andre overflatiske strukturer i hjernen som kortikale regionene der ChR2 uttrykk drives i bestemte populasjoner av nerveceller gjennom virale vektorer eller via en transgen mus linje 10.
Med LED implantasjon, er vi stand til å gjelde kronisk optiske stimulering til å studere den funksjonelle rollen til luktelappen voksen neurogenesis i våken oppføre dyr. Denne enkle lyskilde gir en rask temporal kontroll av lys takket være egentlig raske on / off hastighet av lysdioder. I tillegg til å være billig, produserer en miniatyr LED lyskilde nok strøm (~ 100mW) for ChR2 aktivering i et stort volum av hjernenvev 11, også bilateralt i tilfelle av olfactory pærer. Dette er spesielt viktig i denne hjernen regionen hvor betydelige lesjoner kan være uten effekt på lukt kvalitet oppfatning på grunn av en høy grad av redundans i innspill fra olfactory epitelet 12. Takket være dens kraft og spektral båndbredde (25nm), kan disse miniatyr lysdioder brukes til lys-evoked eksitasjon bruke ChR2 samt andre versjoner av channelrhodopsins som Cheta eller fangst. Miniatyr gul (597nm) og rødt (624 eller 637nm) LED er tilgjengelige for å bli brukt for rød-forskjøvet rhodopsins som halorhodopsin og VChR1 13.
Miniatyr lysdioder viser også begrensninger. For å unngå oppvarming av hjernen, må et kompromiss være funnet mellom pulsvarighet, pulsfrekvens og lysintensitet. For eksempel er korte lyspulser av 5 millisekunder anbefales ved høye frekvenser (> 20Hz) og lysintensitet på 100 mW. Over denne varigheten, en significmaur heving av temperaturen (~ 1-4 ° C) i det omkringliggende vevet kan måles. Denne parameteren bør tas i betraktning for lengre lyspulser (> 5ms) eller kontinuerlig lys stimulering, særlig i tilfelle av lys-fremkalt hyperpolarization bruker halorhodopsin. I tillegg gir den nåværende leverer LED sterke elektriske gjenstand, som kan utelukke in vivo elektrofysiologiske opptak når LED er i direkte kontakt med vev. Laser-coupled optiske fibre utgjøre et mulig alternativ, slik at en mindre og mer begrensede optiske stimulering. Imidlertid kan den stivhet av optiske fibre forstyrre visse atferd.
Etter karakterisere av lyset penetrasjon og funksjonelle stimulering av nerveceller av lys, kan in vivo optisk stimulering utløses i kombinasjon med atferdsvansker eksperimenter. Spesiell forsiktighet bør utvises knyttet til tidspunktet for stimuleringen. Synkronisering av photostimuningen med en bestemt atferd eller oppgave i et atferdsmessig apparat, særlig under operant betinging, kan være avgjørende for å etablere en årsakssammenheng mellom celle aktivering og atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av livsforsikringsselskap "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), den Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" i rammen av "ERA-NET neuron" av FP7 program av Europakommisjonen, "Foundation pour la Recherche Medicale", den Letten Foundation og Pasteur Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
