Summary
Koku ampul Yetişkin doğumlu nöronlar optogenetically Channelrhodopsin2-implant minyatür rostral göçmen akışı ve kronik photostimulation lentiviral enjeksiyon ifade LED kullanılarak kontrol edilebilir.
Abstract
Yerel internöronlar 1-3 yetişkin kemirgenler koku ampul sürekli yeniden üretilir. Bu süreçte, nöral kök hücreler lateral ventrikül duvarları boyunca birkaç milimetre koku ampul içine ulaşmak ve birleştirmek için rostral göçmen akışı (RMS) için göç neuroblasts doğuran, yetişkin nöron denir. Farklı adımlar ve koku alma devreleri önceden var olan yetişkin doğan nöron entegrasyon etkisini incelemek için, nöronların bu özel nüfus aktivitesini seçici etiket ve işlemek için gereklidir. Optogenetic teknolojilerinin en son gelişme, tam çevre nöronlar 4,5 etkilemeden nöronların bu özel kohort aktive etmek için ışık kullanma fırsatı sunuyor . Burada koku ampul ulaşmadan RMS neuroblasts zamansal olarak sınırlı bir kohort viral ifade Channelrhodopsin2 prosedürleri bir dizi (ChR2)-YFP mevcut ve ne yetişkin doğumlu olmakurons. Buna ek olarak, kronik ChR2-ifade nöronlar in vivo uyarılması için LED minyatür bir implant ve kalibre etmek için nasıl göstermektedir.
Protocol
1. Stereotaksik enjeksiyonları
- Bu deneylerde kullanılan virüs, HIV virüsü Channelrhodopsine2-YFP (sarı floresan proteini) ifade dayalı bir çoğaltma eksik lentiviral vektör füzyon synapsin organizatörü 6 tarafından tahrik oluşturmak . Plazmid K. Deisseroth 'nin araştırma grubu (cömertçe sağlanan http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/index.html ). Lentiviruses laboratuar kurulmuş protokolleri 7 göre, ticari kaynaklardan elde edilen veya üretilen olabilir. Ortalama vektör titreleri 10 10 transdüksiyon ünite / ml sipariş edildi. Viral alikotları -80 ° C'de saklanır ve sadece pipet yüklemeden önce çözülmüş olmalıdır. Birden fazla donma / çözülme döngüsü kaçınılmalıdır. Asla kuru buz doğrudan maruz kalma virüs çözümü.
- Cam pipetler, standart pipet çektirmesi (Sutter P borosilikat cam kapilerleri kullanarak hazırlayın-97 Pipet çektirmesi). Çekerek ayarı düzgün, uzun ve sert bir pipet verim kalibre edilmelidir. Sonra, çapı 30-40 mikron bir ipucu elde etmek için bir makas kullanarak pipet ucu kesilir. Mağaza tozsuz bir kutuya pipetler çekti.
- 50 nL teslimat için üreticinin talimatlarına Nanoject II mikroenjektör Kur. Mineral yağ ile geri-dolgu enjeksiyonu pipet hazırlayın ve mikroenjektör piston yerleştirin. Mikroenjektör stereotaksik bir çerçeve üzerine takın. Kısmen boş yağ virüs çözümü ile doldurmadan önce cam pipet
- Mikropipet Parafilm steril bir parça üzerine 2 ul virüs çözümü transfer. Virüs çözümü açılan cam pipet yavaşça alt ve 1-2 ul pipet doldurun. Pipet hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
- 100 mg / kg Ketamin ve steril serum fizyolojik içinde sulandırılmış 10 mg / kg Xylazine, bir fare anestezisi. Kafa derisi, saç çıkarınkemirgen makası, jilet, makas, ya da kimyasal depilitory ajan kullanılarak yapılan hayvan. % 70 etanol ve betadin alternatif üç uygulama ile saçlı deri dezenfekte edin. Tüm cerrahi aletler de otoklavlanabilir ve daha sonra% 70'lik alkol ile dezenfekte edilmelidir. Baş güvenli olmasını temin etmek, hayvan, kulak çubukları ve burun bar ile stereotaksik çerçeve yerleştirin. Kornealar kurumasını önlemek için göz merhemi sürün.
- Bir neşter ile, gözler arasındaki kulağı arasında kafa derisi kesilir. Deri, kafatası maruz ve kelepçeler bir çift deri çapa kenara çekin. Kafatası yüzeyini temizleyin. Stereotaksik aparat bregma cam pipet ucu ile sıfırlanır. Daha sonra ucu (Medio-Lateral, hem de sağ ve sol hemisferde ± 0.82, sırasıyla Antero-posterior, 3.30) enjeksiyon yerinde konumlandırılmış. Burun çubuğunun konumu stereotaksik koordinatlarını hesaplamasına göre ayarlanmalıdır. Yaptığımız denemelerde, burun çubuğu u ayarlanır.ntil bregma ve enjeksiyon yerinde aynı yükseklikte hizalanır.
- Enjeksiyon yeri belirleyin. Yüksek hızlı bir cerrahi matkap kullanarak, dikkatli bir şekilde kafatasına delik. Ucunda çengel bükük bir şırınga iğnesi ile duramater ortaya çıkarmak için ince kemik kalıntıları çıkarın. Deliğe doğru pozisyonda merkezli olup olmadığını kontrol edin. Delme sırasında beynin yüzey rüptürü kan damarları etmemeye dikkat çekin. Eğer kan damarları parçalanır kan akışı durana kadar, birkaç saniye için küçük bir pamuklu bir çubukla veya doku ile beynin yüzeyine hafifçe basın.
- Alt pipet ve pipet ucu, beynin yüzey dokunduğunda dorso-ventral yüksekliği sıfır. Sonra, doğru dorso-ventral derinliği (beyin yüzeyinden 2.9, dorso-ventral), alt ve basınç denge için 30 saniye bekleyin. 200 nl toplam 4 kez 50 nl virüs enjekte edilir. Her enjeksiyon arasında 30 saniye bekleyin.
- Bir dakika, son enjeksiyondan sonra yavaş yavaş boru geritte. Tekrar diğer yarımkürede için 1.6-1.8 puan. Stereotaksik aparat hayvan çıkarın kesi ve dikiş cerrahi konuları ile kesilmiş deri temiz. Hayvan kafesine dönmeden önce ısınma pad üzerinde kurtarmak için izin verin. Ayrıca, hayvanlar hemen sonra bir non-steroid anti-inflamatuar, analjezik (örneğin, Carprofen 4mg/kg) verilen ve 3 gün cerrahisi sonrası olabilir.
2. Koku ampul in vivo optogenetic stimülasyon LED Kronik implantasyon
- Lentiviral parçacıkları ile enjekte Hayvanlar bilateral sonraki kronik bir minyatür mavi LED (Osram, LED CMS 4.6W mavi) implante edilir. Konektörü LED ters tarafta konumlandırılmış, böylece bir kadın minyatür elektrik bağlantısı Lehim LED pimleri. Elektrik kısa kesilmiş olduğunu kontrol edin ve konektörü üzerindeki olumlu ve olumsuz pin belirlemek. LED, uygun bir kablo olsa LED için geçerli bir denetleyici bağlayarak test edin.
- LED mutlak ışık güç ölçmek ve / veya ayarlamak için monte mikromanipülatör ve pozisyon LED, pik, 470 nm dalga boyunda ışık yoğunluğu bir güç metre Fotodedektör ile doğrudan temas LED. Opak bir PVC kurulu 3 mm çapındaki bir iğne deliği delin. Yapıştırmayın bu güç ölçer iğne deliği ve optik güç karşı mm 2 başına gücünü hesaplamak için geçerli giriş bir standart eğri oluşturmak.
- Beyin sayesinde ışığın yayılımı ölçmek için, 300 taze beyin dokusu blokları, 500, 1000, 1500 ve 2500 mikron kalınlık 0-4 vibratome 14 ° C ACSF kesti. LED altında canlı farelerde yapılan bir aynısı olan bir kraniotomi ile bir kafatası parçası yerleştirin. İlk olarak, LED merkezli doku olmadan ışık gücü ölçer. Daha sonra, LED ve güç metre fotodetektör arasındaki doku her blokta yer ve güç ölçmek. Oranı olarak hesaplanan doku kalınlığı karşı göreceli iletim fraksiyonu bir eğri, Yapdoku yoluyla ve doku olmadan ölçülen güç arasında.
- 100 mg / kg Ketamin ve steril serum fizyolojik içinde sulandırılmış 10 mg / kg Xylazine, bir fare anestezisi. LED% 70 etanol ile temizleyin ve dezenfekte edin. Hayvan derisi saç çıkarın ve% 70 etanol ve betadin alternatif üç uygulama ile saçlı deri dezenfekte edin. Sonra stereotaksik çerçeve içinde hayvan yerleştirin. Kornealar kurumasını önlemek için göz merhemi sürün. Stereotaksik sahibine konnektörü takın. Koku ampulü üzerinde kafatası yüzeyinde mükemmel yatay ve LED minyatür yüzeyine paralel kadar burun çubuğunun konumu ayarlanabilir olmalıdır.
- Bir neşter ile kafa derisi, 3 mm 3 mm kulakları posterior gözleri önünde kesti. Deri bir kenara çekin ve kelepçeler bir çift çapa. Jilet kullanarak kafatasının yüzeyindeki membranlar kazınması gerekir. Temiz ve kuru kafatası. Siyanoakrilat yapıştırıcı ince bir kapak uygulayın sonraki reklama izindiş akrilik hesion.
- Koku ampullere göre; yüksek hızlı bir cerrahi matkap kullanarak, dikdörtgen bir kraniotomi (5.1 mm kaudal merkezli, bregma yanal 0 mm 1 mm kaudal ve lateral 3 mm). Bunu yapmak için dikkatlice ince kafatası, sadece ince bir tabaka kemik kalana kadar. Kalan kemik bükük bir şırınga iğne yardımı ile dikkatlice çıkarın. Özel bakım dura madde delinmesiyle ve iki hemisfer arasında ve koku ampul kaudal sınırında bulunan ana kan damarlarının çatlaması önlemek için alınmalıdır. Beyin yüzeyindeki kan birikimi ve pıhtılaşma dokuya optimum ışık geçişini engellemektedir. Kraniotomi ve steril serum fizyolojik ile beyin yüzeyi durulayın ve sonra kafatası kuru.
- Konektörü LED minyatür takın. Koku ampuller LED minyatür indirin. Minyatür LED ana ekseni, steril tuzlu su ve d ile temizleyin fare rostral-kaudal eksenine paralel olmalıdırry kafatası. Sonra güvenli bir kafatası, ikinci bir diş akrilik tabakası tarafından takip akrilik bir ilk katman (yani, polikarboksilat çimento) ile LED . Iki küçük vida Ayrıca LED düzeltmek için gerekli olabilir. Kafatası üzerinde vidalar yerleştirilir (LED pozisyon posterior) ve her iki akrilik ile kaplı olmalıdır. Akrilik hala sıvı iken, kafa derisi serbest kenarları, diş akrilik yüzeyinde geri çekin ve tutkal. Konnektör üzerinde herhangi bir akrilik uygulamak için özen gösterin. Akrilik sertleştikten sonra, stereotaksik cihazdan kaldırmak ve hayvan kafesine geri dönmeden önce bir ısınma pad üzerinde kurtarmanızı sağlar. Hayvanlar en az yedi gün ameliyat kurtarmak için kafes içinde izole bırakılır. Ayrıca, hayvanlar hemen sonra bir non-steroid anti-inflamatuar, analjezik (örneğin, Carprofen 4mg/kg) verilen ve 3 gün cerrahisi sonrası olabilir. LED'ler deneyler implantasyon öncesi ve sona ermesinden sonra test edilmelidir.
- Hafif elektriklical kablosu LED LED zamanlama ve yoğunluğunu kontrol etmek için bir nabız jeneratörü (Master-8) birleştiğinde bir akım denetleyici halata hayvan için kullanılır. Ince bir kablo tam bir hareket özgürlüğü sağlar. Konektör polarite saygı dikkat edin. Tersini polarite LED kırılabilir.
3. Temsilcisi Sonuçlar:
ChR2-YFP, yaklaşık 48 saat sonra enjeksiyon nöronlar transduced ifade ve birkaç ay 7 için sabit kalır . Şekil 1 15 gün sonrası enjeksiyon paraformaldehid sabit hayvan sagital bölümün temsili bir resim. Yoğun etiketleme ve RMS enjeksiyon yerinde boyutunu unutmayın. Yeni doğan hücrelerin çok sayıda koku ampul (Şekil 1) farklı katmanları kolonize RMS boyunca göç etmiştir. Soma, dendrit ve dikenler de dahil olmak üzere tüm nöron bölmeleri, füzyon proteini ifade edilir.
Minyatür LED impla ntation ilgi geniş bir bölgenin büyük ölçekli ve ucuz optik stimülasyon sağlar. Hayvan tam bir hareket özgürlüğü sağlar hafif bir elektrik kablosu ile LED denetleyicisine bağlı. Beyin dokusu ve ChR2 aktivasyon eşiği ışık difüzyon karakterize, biz bu optik aktivasyon LED yüzeyinin altında (Şekil 2A) ~ 2mm derinlikte tetiklemiş olabileceğini tahmin ediyoruz. Fonksiyonel aktivasyon izlemek için ChR2 ifade in vivo nöronlar, nöronal aktivitenin bir belirteci olan c-fos, ifade tekrarlayan ışık stimülasyonu (Şekil 2B) sonra analiz edilebilir. Alternatif olarak, 14 odak ışık uyarımı birleştiğinde ChR2 ifade nöronlar in vitro elektrofizyolojik kayıtlar yapılabilir. Son olarak, iki foton hedef gevşek yama kayıtları, in vivo 9 LED benzer minyatür ChR2-ifade kortikal nöronların fonksiyonel aktivasyon çalışma kullanılmaktadır .
ntent ">
Şekil 1. Rostral RMS lentivirüs enjeksiyonları 15 gün sonra bir fare koku ampul saggital bölümden ChR2-YFP rostral göçmen akışı içine lentiviral enjeksiyon ifade Temsilcisi konfokal görüntüler. OB farklı katmanları RMS sonundan itibaren göç dağınık YFP yenidoğan nöronların varlığını unutmayın. Çoğu yeni doğan hücreleri (% 95), soma Granül Hücre Katmanı (GCL) ve dendritler yalan Dış Pleksiform Layer (EPL) arborize granül hücreleri,. Yeni doğan nöron küçük bir nüfusu kadar göç Glomerüler Katman OB en yüzeysel tabakası, (GL). Ölçek çubuğu, 100μm. ChR2-YFP membran ifade dendritler yanı sıra dikenler de gösteren yeni doğmuş bir granül hücresi Ankastre, yüksek büyütme. Ölçek çubuğu, 20μm.
Şekil 2. Diyagram yeni granül hücreler ifade ChR2-YFP koku ampul ve ışık uyarılmış c-fos ifade üst LED implante.
Implante koku ampuller üzerindeki LED, şematik çizim.
B gösteren Temsilcisi konfokal görüntüleri çift etiketli ChR2 YFP + c-fos + granül hücrelerinin koku ampul ışık uyarılması bir saat sonra. C-fos ifade tavşan anti-c-fos primer antikor (Calbiochem 1:5000) ve A568-konjuge anti-tavşan sekonder antikoru (Invitrogen, 1:1000) kullanarak ortaya çıkıyor. Ölçek çubuğu, 10μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optogenetic araçları son zamanlarda koku sistemi yetişkin doğan nöronlar da dahil olmak üzere seçici nöronal nüfus üzerinde kontrolü sıkılaştırdı. Burada yetişkin doğumlu nöronlar belirli bir nüfus ChR2 YFP ifade lentiviral vektör stereotaksik enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır. Enjeksiyon sonrası dönemde dikkatli bir şekilde izleyerek, bir kohort görece homojen bir yaş ile yetişkin doğumlu nöronların aktivitesini analiz etmek ve işlemek için edebiliyoruz.
Çünkü düşük difüzyon yayılması, yüksek transduction verimliliği ve RMS neuroblasts için onların göreceli iyi tropizm retrovirüsler veya adeno-ilişkili virüs (AAV) gibi diğer viral vektörler, lentiviral vektörler göre tercih edilmelidir. Seçici, örneğin kök hücre ya da atalarıdır olarak bölünen hücreleri enfekte Çünkü, retrovirüs vektörler subventricular bölgeye enjekte ve yeni doğan nöron daha küçük bir nüfus transduce olmalıdır. Lentiviral v ile karşılaştırıldığındaectors, AAV vektörleri çok daha yüksek bir enfeksiyon yayılmasını sağlar. Ancak, RMS neuroblasts AAV transdüksiyon aksesuar koku çekirdeği, projeler koku ampul geri aksonlar bir bölge olarak çevredeki yapıların transdüksiyon nedeniyle kaçınılmalıdır. Son olarak, ChR2 ifade viral vektörler aracılığıyla nöronların belirli popülasyonlarda veya transgenik fare hattı 10 ile tahrik olan kortikal bölge olarak beynin diğer yüzeysel yapılara uygulanabilir implante LED'ler kullanın.
LED implantasyonu ile, uyanık davranmak hayvanların koku alma ampul yetişkin nöron işlevsel rolü çalışma kronik optik stimülasyonu uygulamak mümkün. Bu basit ışık kaynağı, açık / kapalı LED hızı özünde hızlı ışık sayesinde hızlı bir temporal kontrolü sağlar. Ucuz olmasının yanı sıra, minyatür bir LED ışık kaynağı, büyük bir beyin hacmi ChR2 aktivasyonu için yeterli gücü (~ 100mW) üretirdoku 11, hatta bilateral olfaktor ampul durumda. Bu önemli lezyonlar, fazlalık yüksek derecede koku epiteli 12 girişleri nedeniyle koku kalite algısı üzerindeki etkisi olmadan bu beyin bölgede özellikle önemlidir . Gücünü ve spektral bant genişliği (25nm) sayesinde, bu minyatür LED'ler ChR2 olarak hem de böyle Cheta ya da yakalamak channelrhodopsins diğerleri sürümleri kullanılarak ışığın uyarılmış uyarma için kullanılabilir. Minyatür sarı (597nm) ve kırmızı (624 ve 637nm) LED'ler halorhodopsin ve VChR1 13 olarak kırmızı-kaymıştır rhodopsins kullanılmak üzere mevcuttur.
Minyatür LED'ler de sınırlamalar göstermektedir. Beyin ısıtma önlemek için, darbe süresi, darbe frekans ve ışık şiddeti arasında bir uzlaşma olmalıdır. Örneğin, 5 milisaniyelik kısa ışık darbeleri, yüksek frekanslar için (> 20 Hz) ve ışık yoğunluğu 100 mW tavsiye edilir . Bu süre şeyden önce, bir significçevreleyen doku sıcaklığı (~ 1-4 ° C) karınca yükseklik ölçülebilmektedir. Bu parametre özellikle halorhodopsin kullanarak ışığın uyarılmış hiperpolarizasyon durumda, daha uzun ışık darbeleri (5ms) ya da sürekli ışık uyarımı dikkate alınması gerekir. Buna ek olarak, LED sağlayan güçlü elektrik artifakı, LED doku ile direkt temas olduğunda in vivo elektrofizyolojik kayıtlar engel olabilir sağlar. Daha küçük ve daha kısıtlı bir optik stimülasyon sağlayan optik fiberler, olası bir alternatif teşkil Lazer çiftli. Ancak, optik fiberler katılık, bazı davranışları etkileyebilir.
Işık penetrasyon ve ışık nöronların fonksiyonel stimülasyon karakterize sonra, davranışsal deneyler ile birlikte in vivo optik stimülasyon tetiklenebilir. Özel bakım stimülasyon zamanlaması ile ilgili alınmalıdır. Photostimu senkronizasyonudavranışsal bir aparat özellikle edimsel koşullanma sırasında belirli bir davranış veya görev, yürüyemiyordu hücre aktivasyonu ve davranışları arasında bir illiyet bağının kurulması için belirleyici olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, hayat sigortası şirketi "Novalis-Taitbout" Ecole des Nörobilim de Paris (AKP), Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004", "ERA-NET NÖRON" çerçevesinde tarafından desteklenen FP7 programı, Avrupa Komisyonu tarafından "Vakfı pour la Recherche medicale" Letten Vakfı ve Pasteur Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompum 0.2% | |
| Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Glass Capillaries (3.5") | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 | |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN | |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fisher Scientific | BL5.36Z | |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 | |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 | |
| Optical power meter | Thorlabs Inc. | PM100 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 | |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) | |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC International | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) | |
| Carprofen | Pfizer Pharma GmbH | Rimadyl |
References
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 Forthcoming.
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
