Summary
Fænotypiske variation for egenskaber kan skyldes mutationer i cis-regulerende element (CRE) sekvenser, der kontrollerer genekspression mønstre. Metoder afledt til brug i Drosophila melanogaster kan kvantitativt sammenligne niveauet af rumlige og tidsmæssige mønstre af genekspression medieret ved ændret eller naturligt forekommende CRE varianter.
Abstract
Genekspression mønstre er specificeret af cis-regulerende element (CRE) sekvenser, som også kaldes smagsforstærkere eller cis-regulerende moduler. En typisk CRE besidder et arrangement af bindingssteder for flere transskription faktor, proteiner, der giver en regulerende logik, der angiver, hvornår, hvor og på hvilket niveau de regulerede gen (s) er udtrykt. Det fulde sæt af Cres inden for et dyr genom koder organismens program for udvikling 1, og empiriske og teoretiske undersøgelser viser, at mutationer i Cres spillet en fremtrædende rolle i morfologiske udvikling 2-4. Desuden menneskelige genom bred forening undersøgelser viser, at den genetiske variation i Cres bidrage væsentligt til fænotypisk variation 5,6. Således, forståelse lovgivningsmæssige logik og hvordan mutationer påvirker en sådan logik er et centralt mål for genetik.
Reporter transgener give en kraftfuld metode til at studere in vivo-funktionertion af Cres. Her en kendt eller mistænkt CRE sekvens er koblet til heterologe promotor og kodningssekvenser for en reporter gen, der koder en let observerbar protein produkt. Når en journalist transgen er indsat i en værtsorganisme, at CRE aktivitet bliver synlig i form af den indkodede reporter protein. P-element medieret transgenese i bananfluen arten Drosophila (D.) melanogaster 7 er blevet brugt i årtier til at indføre reporter transgener i denne model organisme, selvom det genomiske placeringen af transgener er tilfældig. Derfor er reporter geners aktivitet stærkt påvirket af den lokale kromatin og gen-miljø, der begrænser CRE sammenligninger til at være kvalitative. I de senere år var phiC31 baseret integration, som er tilpasset til brug i D. melanogaster at indsætte transgener i specifikke genom landingssteder 8-10. Denne mulighed har gjort kvantitativ måling af gen-og, relevant her, CRE aktivitet 11-13 feasible. Produktionen af transgene bananfluer kan outsources, herunder phiC31-baseret integration, hvilket eliminerer behovet for at købe dyrt udstyr og / eller have samme færdigheder på specialiserede transgenet injektion protokoller.
Her præsenterer vi en generel protokol til kvantitativt evaluere en CRE aktivitet, og vise, hvordan denne tilgang kan bruges til at måle virkningerne af en introduceret mutation på en CRE aktivitet og til at sammenligne aktiviteter orthologous Cres. Selv om de anførte eksempler er for en CRE aktive under frugtflue metamorfose, kan den fremgangsmåde anvendes på andre udviklingsstadier, frugt flyve arter, eller model organismer. I sidste ende bør en mere udbredt anvendelse af denne metode til at studere Cres fremme en forståelse af lovgivningsmæssige logik og hvordan logik kan variere og udvikle sig.
Protocol
Oversigt:
Denne video viser en protokol i stand til kvantitativt at måle genet regulerende aktiviteter for cis-regulerende element (CRE) sekvenser i Drosophila (D.) melanogaster. Denne protokol kan bruges til at sammenligne de lovgivningsmæssige aktiviteter i besiddelse af: vild type og mutant CRE former, naturligt forekommende CRE alleler findes inden for en art, eller orthologous Cres mellem afveg arter.
1. Site-specifik integration af journalist transgener i Drosophila melanogaster genomet
A. Reporter transgenet byggeri
- Som et første skridt, evalueres enhver CRE skal være særskilt klonet til en journalist vektor, der indeholder en (1) attB bakteriel fastgørelse hjemmeside sekvens anvendes til site-specifikke transgen integration 8-11, (2) flere kloning hjemmeside opstrøms for et (3) heterolog projektholder, der er efterfulgt af (4) kodende sekvens for et fluorescerendeprotein (såsom EGFP eller DsRed).
- Mens enhver vektor kan gøres kompatible for phiC31 medieret stedsspecifikke integration ved at indføre en attB sekvens i vektor rygraden, vektor pS3aG12-14 kan fås fra addgene plasmidet repository (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG er en tilpasset version af P-baserede transformation vector15, hvor en af de to sigøjner-isolatorer blev erstattet af en SfIb isolator, det indeholder en forbedret flere kloning site, og besidder en 250 basepar sekvens, der indeholder en attB vedhæftet fil site. Cres af interesse er indsat i flere kloning sted opstrøms af en HSP70 minimal promotor og EGFP gen, der koder for en forbedret version af Green Fluorescent protein, der lokaliserer til kernen.
B. Specifikke integration af journalist transgener
- For et sæt Cres, hvis aktiviteter er at være sammenligned som en del af journalist transgene vektorer, er de skabt vektorer separat integreret i det samme genomiske landing sted. Her phiC31 fag integrase protein katalyserer ensrettede rekombination mellem bakteriel (attB) vedhæftet fil site i transgenet vektor og en genomically placeret fag (attP) vedhæftet websted 9. Flere grupper 8-11 har lavet en bred vifte af transgene linier, der indeholder en attP stedet (såkaldte landingssteder) og indeholder en genomisk kilde 8 af phiC31 som udtrykker dette protein i kimceller. Disse flyve lagre let kan fremskaffes fra Bloomington Drosophila bestanden center (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- En offentliggjort protokol eksisterer beskriver hvordan man kan skabe transgene Drosophila site-specifikt bruger phiC31 integrase 16. Det udstyr og teknisk ekspertise til at gøre transgene Drosophila liNES er ikke længere påkrævet, da flere leverandører eksisterer (tabel 1), til hvem denne service kan outsources.
- Transgen adfærd kan variere meget fra den ene væv til de næste 11. Derfor vil en enkelt attP landing site er ikke optimal til analyse af alle Cres, udviklingsstadier, og / eller væv af undersøgelsen. Det er tilrådeligt at vurdere aktiviteten af en CRE af interesse i flere forskellige landingspladser for at finde et sted, hvor CRE aktivitet er repræsentativ for den endogene målet genet (r) udtryk mønster.
- For opnåede transgene linier er det tilrådeligt at gøre dem homozygot for transgenet. CRE aktivitet er generelt mere robust i personer med to kopier af transgenet og kvantitative målinger er det bydende nødvendigt, at der foretages sammenligninger mellem personer med samme antal transgenet kopier. Homozygote individer kan opnås gennem brug af balancer kromosomer. For velkarakteriserede landingssteder er det dog ofte erimpler at indsamle jomfru hanner og hunner, og krydser dem med de mere intense øjenfarve fænotype er tillagt ved mini-white genet (fig. 1), som den hvide mutant redning fra den integrerede transgenet vektoren er mere dramatisk hos personer med to vektor kopier.
2. Indhentning af prøver eller væv af passende udviklingsstadiet
Anskaf prøver til analyse på det tidspunkt i udviklingen, hvor genekspression mønster (r) af interesse opstå (r) endogent, og dermed det tidspunkt, hvor CRE omfattet af undersøgelsen skal aktivere reporter genekspression. For Drosophila, kan dette være enten embryonale, larve, puppe eller voksne stadier. Nedenfor vi beskriver en metode til at iscenesætte voksne og metamorfe fluer, hvor sidstnævnte finder sted inde i puparium, en hård larvehud, der indeholder immobile prøven, indtil det ecloses som en voksen.
- Udvid transgene linier for at sikre specimENS af korrekt fase er tilgængelige når de er klar til at analysere reporter genekspression ved konfokal mikroskopi. Nedsat to hætteglas med flere (~ 5 - 10) mandlige og kvindelige fluer. På vekslende dage bump fluerne fra en af de hætteglas til en ubrugt hætteglasset. Gentag dette for en uge. Ved udgangen af to uger, vil transgene bananfluer være til rådighed, der spænder fra larve til voksen udviklingsstadier.
- Iscenesættelse voksne fluer: Varigheden af tid tilbragt i et puparium er 98 timer for kvinder og 102 timer for mænd, når der opdrættes ved 25 ° C. Voksne fluer kan let indsamles, når de dukker op fra puparium (kaldet eclosion). Dette Tidspunkt kan betragtes som 0 timer indlæg eclosion. Voksne fluer kan opdrættes, indtil det ønskede Tidspunkt for analyse. For eksempel kaldes en CRE mel-oe1, der styrer udtryk for desatF gen i den voksne oenocytes af D. melanogaster kvinder er ikke aktiv umiddelbart efter eclosion men CRE aktivitet SWItches på efter en dag 14. Når den korrekte fase er opnået, bedøver fluer og placere i en dråbe Halocarbon olie på et dias og gå videre til konfokal evaluering.
- Iscenesættelse prøver under forvandling: I slutningen af tredje-instar larvestadiet de puparium er dannet. Selv på dette tidspunkt dyret teknisk set stadig tredjedel instar larve, denne udviklingsfase er let at identificere som prøven er ikke-mobile, det puparium er blød og hvid, og Spirakler har everteret (Fig. 2A). Dette Tidspunkt kan betragtes som 0 timer Efter Puparium Dannelse (hAPF). På dette stadium, kan mænd skelnes fra hunner af tilstedeværelsen af bilateralt ligger gonader nær midtpunktet af kroppen, der vises som gennemsigtige cirkler (boxed i Fig. 2A og afmærket ved sort pil i 2A ").
1. Iscenesættelse baseret på længden af metamorfose:
Ved 0 hAPF, kan prøver overføres til et nyt hætteglaseller en petriskål med en fugtet pensel. For at holde prøver fra udtørring, tilføje et stykke Kimwipe og fugtes med vand. Overførsel hætteglas eller parabol til et 25 ° C inkubator, indtil den ønskede hAPF.
2. Iscenesættelse af synlige morfologiske egenskaber:
Det er ofte besværligt at analysere prøver for CRE aktivitet på et bestemt Tidspunkt efter indsamlingen af 0 hAPF prøver. Alternativt kan man identificere korrekt iscenesat prøver på et tidspunkt, der passer til analyse baseret på tilstedeværelsen og placeringen af flere morfologiske markører (nedenfor), der er synlige gennem puparium eller efter puparium fjernelse (fig. 2).
2a. Morfologiske kriterier for indbyrdes tilnærmelse af metamorfe fase:
- 0 hAPF: Hvid prepupa fase, hvor larve holder stille; anterior Spirakler everteret (pil på Fig 2A.) Laterale luftrøret synlige, blød hvid puparium (Fig. 2A).
- ~ 14 hAPF:Puparium garvet og forhærdede; hovedet SAC everteret, lateral luftrøret og gonader mindre adskilte, ben og vinger helt ud langs maven; Malpighian tubuli endnu ikke fremtrædende og grøn (stiplet indrammede område i figur 2B.) Øjne er upigmenterede (Fig. 2B) .
- ~ 25 hAPF: To parallelle Malpighian tubuli fremtrædende og grønne farve (stiplet indrammede område i figur 2C.).
- ~ 40 hAPF: Mørkegrøn gule legeme placeret mellem den forreste ende af Malpighian tubuli (rød pilespids i Fig 2D.).
- ~ 50 hAPF: gule legeme placeret i midtpunktet af Malpighian tubuli (. Boxed regionen i Fig 2E og udvidet i 2E''), og øjnene er gule i farven, hvis vildtype for hvide gen (nødvendig for rød øjenfarve) . Øjenfarve mangler på dette tidspunkt, da den hvide mutant fænotypen er reddet af mini-hvide gen, som er en del af den integrerede reporter transgenet vektor (fig. 2E «).
- ~ 80 hAPF: Wing tips grå; Malpighian tubuli placeret mellem anterior til midten af underlivet (. Boxed regionen i Fig 2G og udvidet i 2G "); folder mellem abdominal segmenter og børster på den abdominale tergites er synlige (Fig. 2G og 2G ") og reddet øjenfarve er lys rød (Fig. 2G").
- ~ 90 hAPF: Wings formørket til sort, Malpighian tubuli og gul krop skjult af garvning af tergites, thorax (pil) og abdominal børster er modne og formørket (fig. 2H) og grønne mekonium vises på ryg bageste spids på maven ( Fig. 2H'').
Noter:
- På late stadier af metamorfose, kan sex af prøver fastsættes af genital morfologi (pilespidser i Fig. 2I og 2J) eller tilstedeværelsen af mørke sex kamme på det første sæt af mandlige ben.
- Yderligere præcision i iscenesættelse kan opnås ved overvejelser om yderligere morfologiske markører, som beskrevet tidligere 17.
D. skridt til at fjerne eksemplar fra puparium:
- Ved hjælp af lab tape overholde et stykke tape til en dissektion bord med den klæbende overflade opad.
- Dyp en malerpensel og anvende fugt til pupariated prøver. Ved hjælp af en malerpensel, prøver overførsel til en Kimwipe.
- Brug pincet eller en pensel, overføre prøver til pakning tape og følge med den dorsale opad (buet side af puparium).
- Lad prøver at tørre i ~ 15 minutter. Tør puparium er meget lettere at åbne end dem, der er fugtige. På dette tidspunkt prøver kan groft iscenesat af morfologiskemarkører synlige gennem puparium.
- Brug pincet, gradvis åbne puparium begyndelsen på den forreste Laag og arbejde hen imod den bageste ende. Hvis en mere finskala-dissektion er nødvendig for at isolere et specifikt væv, dette kan gøres på et urglas med PBS løsning. Ellers, overførsel pupper til en dråbe af tyktflydende HC700 Halocarbon olie (Sigma-Aldrich) på et objektglas.
- Placere prøver på et dias, ved hjælp af et stereomikroskop, og ved hjælp af den ovenfor beskrevne kriterier (afsnit 2a) et eksemplar scene kan bestemmes ..
3. Konfokal mikroskopisk evaluering af reporter genekspression i en hel mount prøve
- For hele mount prøver, enten bruge 4X eller 10X mål. Brug af fluorescens stimuleret af kviksølv lampe eksponering, eller alternativt ved at se i lyse felt, skal du justere mikroskop scenen for at placere modellen i det optiske felt derefter bringe prøven i fokus.
- Brug af konfokale microscope software, skal du justere excitation bølgelængde for EGFP (eller en egnet bølgelængde, når du bruger et andet fluorescerende protein).
- For at forhindre fotoblegning en prøve, der begynder med en laser intensitet på 5-10%. Hvis signalet er underwhelming, og derefter øge intensiteten efter behov.
- For at forbedre signal-støj-forhold for konfokal billeder, så software-indstillinger, at den gennemsnitlige pixel målinger fra replikere scanninger, såsom Kalman prisudligning eller linje og stak gennemsnit. Det er vores erfaring Kalman gennemsnit for tre scanninger forbedrer signal-støj-forhold uden at gøre tid til billedsamling for længe.
- For kvantitative sammenligninger af CRE aktivitet, er det vigtigt, at fluorescensintensitet for en model, der ikke har mættet mange pixels. Ved hjælp af en z-sektion, hvor fluorescens forekommer mest intense, skal du justere indstillingerne, så få pixels er mættet. Dette kan gøres ved at skifte til en saturation-advarsel opslagstabel og justere kanal spænding, gain og offsettil indstillinger, hvor kun få pixels er mættet. Endelig, for at indsamle tilstrækkeligt signal fra en model, er det ofte nødvendigt at justere konfokal blænden.
- Når de optimale indstillinger bestemmes, køre z-scanning.
- Når scanningen er færdig konvertere billedstak ind i en projektion og gemme dette billede i den Tagged Image File Format eller "TIFF".
Bemærk:
- Det er vigtigt at bruge de samme konfokale indstillinger for alle replikere prøver og reporter transgen linjer, som vil indgå i en kvantitativ sammenligning af CRE aktiviteter.
4. Kvantificering cis-regulerende element aktivitet
Mens nogle konfokal erhvervelse software giver mulighed for yderligere behandling af projektion billeder, vi foretrækker at bruge den frit tilgængelig Billede J software program til at evaluere konfokal billeder 18. Brug Billede J 18 indspillet GFP udtryk mønstrekan kvantificeres som pixelværdi statistikker inden for et nærmere angivet område. Selvom billeder ikke behøver at være i gråtoner vi foretrækker at gøre det.
- Med billedet J programmet startes, åbner en TIFF-billede, der skal evalueres.
- Klik på frihånd valgknap og skitsere den del af prøven, hvor kvantitering ønskes, for eksempel regionen i figur 3 inden for den stiplede gule grænse. (Se nedenstående note A med hensyn til udvælgelse af et område at kvantificere.)
- For at få en pixelværdi statistik, klik på Analyser fanen og vælg derefter foranstaltning. En resultater boks vil dukke op, der viser området, og det betyder, minimum og maksimum pixelværdien scoringer. Optag den gennemsnitlige pixelværdi score og gentag til at generere pixelværdi statistik for replikere prøver (se note B vedrørende replikere nummer).
- Vi anbefaler at indsamle et andet betyde pixel værdi fra en kontrol region, hvor CRE ikke er aktiv, for eksempel regionen i figur 3 inden for den stiplede røde grænse. Sidstnævnte value kan trækkes fra den tidligere værdi til at fjerne baggrunden effekter fra måling til at få en justeret betyder pixel værdi. Det er vores erfaring dette yderligere reducerer variation mellem replikere prøver (se note C med hensyn til størrelse udvælgelse til kontrol-regionen).
- Brug de justerede gennemsnitlige pixelværdier fra replikere prøver at beregne den gennemsnitlige regulering aktivitet for en CRE, og standarden fejl gennemsnittet. Denne lovgivningsmæssige aktivitet værdi og måling af fejl kan sammenlignes med andre reporter transgener hvor CRE er rækkefølgen forskellig (for eksempel figur 3).
Noter:
- Billede J giver mulighed for brugeren at vælge en defineret form og areal, hvorfra en gennemsnitlig pixelværdi score vil blive fastlagt. Men som prøven størrelse varierer ofte foretrækker vi at bruge Frihånds markeringsværktøjet til at angive det område, der skal evalueres for hver prøve.
- Et større antal replikater (N) resulterer i en bedre vurdering af den gennemsnitlige reguleringlatory aktivitet for en given CRE. Vi finder, at en N mellem 4 og 8 er normalt tilstrækkeligt.
- Det er vores erfaring størrelsen af kontrollen valgte område har meget lidt indflydelse på den målte gennemsnitlige pixel værdi for kontrolområdet. Generelt vælger vi et område proportional i størrelse til området af interesse.
5. Repræsentative resultater:
En vildtype version af en D. melanogaster CRE, kaldet dimorfe Element 13, drev en høj grad af EGFP reporter udtryk i A6 abdominale segment af kvindelige pupper (fig. 3A). En 13 basepar sekvens inden for dette element blev anset for at være et bindingssted for den DSX transskription faktor, og in vivo betydningen af denne sekvens kan påvises ved at kvantificere de lovgivningsmæssige aktivitet for denne CRE når dette bindingssted er muteret. I betragtning af de lovgivningsmæssige aktivitet vild-type dimorfe Element at være 100 ± 5%, mutation af denne DSX hjemmeside reduceret regulatory aktivitet til 28 ± 3%. Tilsvarende sammenligninger kan gøres af lovgivningsmæssige aktiviteter for intraspecifikke CRE alleler eller mellem orthologous Cres fra forskellige arter. For eksempel, i betragtning af niveauet af EGFP hos kvindelige segment A6 drevet af D. melanogaster Canton S stammen som en regulerende aktivitet på 100 ± 4%, orthologous Cres for arten D. simulans og D. willistoni blev fundet henholdsvis besiddelse af lovgivningsmæssige aktiviteter svarende til 75 ± 4% og 0 ± 0% (Fig. 3B).
Figur 1. Brug af intensiteten af den hvide redde øjet fænotype at lave transgene linier homozygote. For at kvantitativt evaluere reporter transgener er det vigtigt, at hver prøve har den samme journalist transgenet genotype. (A) En hvid gen mutant genetiske baggrund med en attP landingsstedet sekvens er udnyttet for site-s PECIFIKKE transgenet integration. Transgene individer (B) hemizygous og (C) homozygote for den integrerede vektor kan typisk være kendetegnet ved intensiteten af den reddede øjenfarve fænotype med antallet af kopier af den integrerede mini hvide gen. Homozygote linier kan etableres ved at krydse (C) mandlige og kvindelige flyver med den mørkeste øjenfarve fænotype.
Figur 2. Ved morfologiske markører for at bestemme metamorfe scenen for Drosophila. Under forvandling fra en larve til en voksen bananfluen,. Prøven overgange gennem en serie af stereotyp morphologies, der kan bruges til at bestemme køn og omtrentlige udviklingsstadiet Prøver i BH er blevet fjernet fra deres puparium. Bokse i paneler A, E, F, G og H angiver zoomet ind regioner henholdsvis til paneler A ", E", F "G", og H ".
"Figur 3" src = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" />
Figur 3. Kvantitativ sammenligning af cis-regulerende element aktiviteter. For alle prøver EGFP-reporter genekspression formidles af en bestemt dimorfe Element blev vurderet hos hunner ved 80 timer efter puparium formation. Tallet i toppen af hvert billede er EGFP-udtryk niveau for prøven, der beregnes som den gennemsnitlige pixel værdi for A6 abdominale segment (indikeret til øverste venstre mest billede som region i den stiplede gule grænsen) minus den gennemsnitlige pixel værdi for A4-segmentet (baggrund korrektion, indiceret til øverste venstre mest billede som region i den stiplede røde grænse). For hver reporter transgen fire replikater blev vurderet til at beregne en gennemsnitlig segment A6 pixel værdi. Regulatory aktivitet er rapporteret som% af (A) vildtype eller (B) Canton S stammen kvindelige betyde pixelværdien ± SEM. (A) GFP udtryk for kvinder besidder en vildtype allel afDimorfe Element og en mutant version, hvor en enkelt bindingssted for den DSX transskription faktor var ablated. Denne mutant bindingssted reduceret dimorfe Element aktivitet til 28 ± 3% af vildtype sekvens. (B) Sammenligning af de lovgivningsmæssige aktiviteter for sekvenser orthologous til D. melanogaster (Canton S stamme) dimorfe Element. I betragtning af GFP udtryk formidles af en D. melanogaster dimorfe Element allel som 100%, de orthologous sekvenser fra de beslægtede arter D. simulans og D. willistoni henholdsvis besiddelse af aktiviteter på 75 ± 4% og 0 ± 0%.
6. Materialer
| Materialets navn | Type | Firma | Katalognummer | Kommentar |
| Site-specifik transgen integration | Tjenesten | Bedste Gene | Plan H | Vælg et landing site, modtage transformant linjer |
| Halocarbon Oil | Reagens | Sigma-Aldrich | H8898 | Bruges til at montere enheder, for konfokal billedbehandling |
| Dumont # 5 Tang | Værktøj | Fin Science Tools | 11252-40 | Fin spidse og holdbare i dissektion |
| SZ61 Zoom stereo mikroskop | Værktøj | Olympus | Kan tilpasses | Fremragende optik til at arbejde med bananfluer |
| FluoView konfokal mikroskop | Værktøj | Olympus | Kan tilpasses | Giver høj opløsning konfokal billeder |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cis-regulerende elementer encode det genomiske program, der angiver genekspression mønstre og dermed processen med udvikling 1, og er prominente steder for både mutationer underliggende morfologiske udvikling 2-4 og fænotypiske variation for menneskelige træk 5,6,19. På trods af denne betydning forbliver den lovgivningsmæssige logik for Cres dårligt forstået. En fremtrædende årsag til denne forståelse underskud har været manglen på egnede metoder til kvantitativt at sammenligne funktionelle sekvenser af Cres. Her præsenterer vi en protokol, der udnytter den forbedrede transgenese metoder til D. melanogaster at tilføje et kvantitativt aspekt til studiet af Cres.
Det er vores erfaring, når kvantificere en CRE-lovgivning, variation mellem gengive eksemplarer, er på 10% eller mindre af den justerede gennemsnitlige pixel værdi, når replikater er (1) af samme udviklingsstadiet, og (2) journalisten transgenet eri samme genomiske landing sted. Dette beløb af variation er i overensstemmelse med, at bestemmes for CRES præsenteret i figur 3, og lægger en begrænsning på brugen af denne kvantitative metode til situationer, hvor genetisk forskellige versioner af en CRE forskellige i lovgivningsmæssig aktivitet ved en værdi større end 10%. Vigtigere er dog, denne begrænsning er en betydelig forbedring i forhold til den kvalitative beskrivelser af "reduceret" eller "øget", at de studerer Cres tidligere havde til at bruge når de skal beskrive varierende aktivitet.
Når versioner af en CRE er kendt eller fundet til kvantitativt forskellige i deres regulerende aktiviteter, denne protokol, der gør muligt at afgøre, hvilke af de mutational forskelle er ansvarlige for eller bidrager til aktiviteten forskellen 12,13. Evnen til at identificere disse funktionelt relevante mutationer er et nødvendigt første skridt for at bestemme de molekylære mekanismer, som gevinsten eller tabet af transcription faktor bindende sites, der forårsager CRE aktiviteter til forskellige. Fremadrettet bør anvendelsen af denne protokol til andre Drosophila Cres og anvendelse af tilsvarende metoder i protokoller for andre modelorganismer give mulighed for en bedre forståelse af CRE logik at dukke op. Dette omfatter en evne til at skelne funktionelt relevante CRE mutationer fra det morads af funktionelt-neutrale mutationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker: Nicolas Gompel og Benjamin Prud'homme for deres bidrag til udviklingen af denne protokol Melissa Williams og fire anonyme anmeldere for kommentarer til manuskriptet, University of Dayton Graduate School for forskning, stipendier til krig, og University of Dayton Biologi Institut og Research Institute (UDRI) for forskning støtte til TMW. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association Grant 11BGIA7280000 til TMW.
References
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
- Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
