Summary
形質の表現型変異は、シス調節エレメント（CRE）のシーケンスを制御する遺伝子の発現パターンの変異に起因することができます。キイロショウジョウバエで使用するために派生メソッドは、定量的に変更されたり、天然に存在するCREの亜種によって媒介遺伝子発現の空間的および時間的パターンのレベルを比較することができます。
Abstract
遺伝子発現パターンは、エンハンサーまたはシス調節モジュールと呼ばれるシス調節エレメント（CRE）のシーケンスで指定されています。典型的なCREは、どこで、どのレベルで安定化された遺伝子（s）が発現されるとき、指定の規制論理を与えるいくつかの転写因子のタンパク質の結合部位の配列を有している。動物のゲノム内でCRESのフルセットは、開発1生物のプログラムを符号化し、経験だけでなく、理論的な研究は、CRESの変異が形態学的進化2-4に顕著な役割を果たしたことを示している。また、人間のゲノムワイド関連研究では、CRESでその遺伝的変異が表現型変異5,6に大きく貢献して示している。従って、規制の論理を理解し、どのように変異がそのようなロジックに影響を与えることは遺伝学の中心的な目標です。
レポーター遺伝子は生体機能の研究に強力な方法を提供するCRESのる。ここに、既知または疑われるCREのシーケンスは、異種プロモーターと容易に観察可能なタンパク質産物をコードするレポーター遺伝子のコード配列に結合されている。レポーター遺伝子は、宿主生物に挿入されると、CREの活動は、エンコードされたレポータータンパク質の形で見えるようになります。導入遺伝子のゲノム配置はランダムですがショウジョウバエ種ショウジョウバエ（D.）ショウジョウバエ 7のP要素媒介形質転換は、このモデル生物にレポータートランスジーンを導入するために何十年も使用されています。従って、レポーター遺伝子の活性を強くされて定性的にCREの比較を制限し、地元のクロマチンと遺伝子の環境によって左右される。近年では、phiC31ベースの統合システムは、特定のゲノムの着陸地点8-10に導入遺伝子を挿入するキイロショウジョウバエでの使用に適応されました。この機能により、定量的な遺伝子の測定と、関連するここで、CREの活動11月13日 FEを行っているasible。トランスジェニックショウジョウバエの生産は、高価な機器を購入および/または専門的な導入遺伝子の注入プロトコルでの能力を持っている必要がなくなり、phiC31ベースの統合を含め、外部委託することができます。
ここで、我々は定量的にCREの活動を評価する一般的なプロトコルを提示し、このアプローチは、CREの活性に対する変異の導入の効果を測定するとオルソロガスCRESの活動を比較するために使用することができる方法を示します。与えられた例はショウジョウバエの変態中にCREアクティブのためですが、アプローチは他の発達段階、ミバエの種、またはモデル生物に適用することができます。最終的には、CRESを研究するためにこのアプローチのより広範な使用は規制の論理の理解を進める必要があり、どのようにロジック変化し、進化させることができます。
Protocol
概要：
このビデオでは、定量的にショウジョウバエ（D.）ショウジョウバエにおけるシス調節エレメント（CRE）のシーケンスのために遺伝子調節の活動を測定することができるプロトコルを示しています。野生型と変異型CREフォーム、天然に存在するCREの種に見られる対立遺伝子、または分岐した種間でオーソログCRES：このプロトコルは、が保有する規制活動を比較するために使用することができます。
1。 キイロショウジョウバエゲノムにレポーターの導入遺伝子の部位特異的統合
A.レポーター導入遺伝子の構築
- 最初のステップとして、任意のCREは別に、サイト固有のトランスジーンの組み込み8月11日のために使用される（1）attB細菌の付着部位の配列、上流（3）の（2）複数のクローニング部位を含むレポーターベクターにクローニングされている必要があります評価蛍光用（4）コード配列が続いている異種プロモータータンパク質（例えば、EGFPまたはDsRedなど）。
- 任意のベクトルは、ベクトルのバックボーンにattB配列を導入することにより、phiC31介したサイト固有の統合に対応させることができますが、ベクトルpS3aG12 - 14はaddgeneプラスミドリポジトリから入手することができます（http://www.addgene.org/pgvec1） pS3aG二つジプシーの絶縁体のいずれかがSfIb絶縁体によって置換されたP -ベースの変換vector15のカスタマイズされたバージョンである、それは強化されたマルチクローニングサイトが含まれており、attB付着部位を含む250塩基対の配列を有している。興味のあるCRESは、HSP70最小プロモーターと核に局在する緑色蛍光蛋白質の強化されたバージョンをエンコードするEGFP遺伝子の上流にマルチクローニングサイトに挿入されます。
B.レポーター導入遺伝子の部位特異的統合
- 活動と比較されるCRESの一連のdは、レポーター遺伝子ベクターの一部として、作成されたベクトルが別々に同一のゲノムの着陸地点に統合されています。ここにphiC31ファージインテグラーゼタンパク質は、遺伝子、ベクターとゲノム的に位置するファージ（attP）付着部位9の細菌（attB）添付ファイルのサイト間の単方向の組換えを触媒する。いくつかのグループは8-11 attPサイト （いわゆる着陸地点）を含むと生殖細胞でこのタンパク質を発現するphiC31のゲノム源8を含むトランスジェニック系統の様々なてきた。これらのハエの株式市場は、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから容易に得ることができる（http://flystocks.bio.indiana.edu/） 。
- 公開されたプロトコルは、phiC31インテグ16を用いてトランスジェニックショウジョウバエ特異的にサイトを作成する方法を詳述するが存在する。トランスジェニックショウジョウバエリチウムを作るために設備と技術的専門知識複数のベンダーが（表1）誰に、このサービスが外部委託することができる存在として、NESは不要になります。
- 導入遺伝子の挙動は、つの組織から次の11に大きく異なる可能性があります。したがって、単一のattPの着陸地点は、すべてのCRES、発育段階、および/ または学習の組織の分析には最適ではありません。それは、CREの活動は、内因性標的遺伝子（群）の発現パターンを代表するサイトを見つけるためにいくつかの別のリンク先サイトに関心のCREの活性を評価することをお勧めします。
- 得られたトランスジェニックラインの場合は、それは導入遺伝子のためのそれらをホモ接合にすることをお勧めします。 CREの活動は、導入遺伝子の2つのコピーを持つ個人で、一般的に、より堅牢であり、定量的な測定のために、それは比較は導入遺伝子のコピー数が同じで、個人間で行われることが不可欠です。ホモ接合個体は、バランサー染色体を使用して取得することができます。しかし十分に特徴付けられた着陸地点の場合、それは多くの場合、sです統合された導入遺伝子のベクトルによって用意されたホワイト変異救助二つベクトルを持つ個人で、より劇的なのでimplerは、処女雄と雌を収集し、 ミニ白の遺伝子（図1）によって与えられるより多くの情熱的な目の色の表現型とのそれらを横断するコピー。
2。適切な発達段階の取得標本または組織
調査中のCREは、レポーター遺伝子の発現を活性化すべき時間従って、目的の遺伝子の発現パターン（s）が発生し、開発の時間（s）内因的に分析するための標本を入手してください。 ショウジョウバエの場合、これはどちらかの胚、幼虫、蛹の大人の段階になります。以下では、成人と変成ハエを上演する方法を説明し、蛹殻、それは大人としてeclosesまで不動の標本が含まれているハード幼生皮膚内部で行われます後者のうち。
- SPECIMを確保するためのトランスジェニック系統を拡大する時共焦点顕微鏡によるレポーター遺伝子の発現を解析する準備ができて、適切な段階でのENSが使用可能です。男性と女性のハエ - いくつかの（10〜5）を持つ2つのバイアル、それぞれを設定します。日が交互に、バイアルのいずれかから未使用のバイアルにハエをバンプ。週間のためにこれを繰り返します。二週間の終わりまでに、トランスジェニックショウジョウバエでは幼生から成体発達ステージにその範囲を利用できるようになります。
- 大人のハエをステージング：25℃飼育するときに蛹殻の内部に費やされる時間の持続時間は女性と男性で102時間の98時間℃である彼らは蛹殻（羽化と呼ばれる）から出てくるときに大人ハエが容易に収集することができます。このタイムポイントは0時間後の羽化と見なすことができます。大人のハエは、分析のために必要なタイムポイントまで飼育することができます。例えば、CREは、D.の成人oenocytesでdesatF遺伝子の発現を制御するMEL - OE1と呼ばれるショウジョウバエの雌はすぐに羽化がCRE活性をSWIの後にアクティブではありません一日14日以降でtches。正しい段階を取得すると、ハエを麻酔し、スライド上のハロカーボンのオイルを一滴に据えると共焦点評価に進みます。
- 変態時の標本をステージング：3齢幼虫の段階の終了時に蛹殻が形成される。この段階で動物が技術的にも、3番目の幼虫ですが、この発達段階では試料が非モバイルなので、蛹殻が柔らかく、白である、と気門が（図2A）evertedて容易に識別可能です。このタイムポイントは0時間蛹殻の形成（hAPF）後に考えることができる。この段階では、男性は半透明の円（箱詰め図2Aおよび2Aに黒い矢印で示された"）として表示されるボディの中間点付近の両側に位置する生殖腺が存在することによって女性と区別することができる。
1。変態の長さに基づいて、ステージング：
0 hAPFで、検体は新鮮なバイアルに転送することができます湿らせた絵筆を使ったり、ペトリ皿。乾燥から標本を保つために、キムワイプの部分を追加し、水で湿らせます。希望hAPFまで25℃インキュベーターにバイアルまたは皿を移す。
2。目に見える形態的特徴によるステージング：
それは0 hAPF標本のコレクションは、次の特定のタイムポイントでCREの活動のための検体を分析するためには不便です。別の方法として、一つは正常に蛹殻を通して、または蛹殻の除去（図2）の後に表示されているいくつかの形態学的マーカー（下記参照）の存在と位置に基づいて分析のために都合のよい時に試料を段階的識別することができます。
2A。変成段階を近似するための形態学的基準：
- 0 hAPF：幼虫の走行が止まれホワイト前蛹の段階、everted前部気門（図2Aの矢印。）目に見える外側気管、柔らかな白い蛹殻（図2A）。
- 〜14 hAPF：日焼けと硬化蛹殻、頭殻機動隊SAC everted、横方向の気管および生殖腺が少なく明瞭、完全に腹に沿って延長脚と翼、（図の点線囲み地域2B）まだ目立つと緑ではないマルピーギ管、眼は無着色されている（図2B'） 。
- 〜25 hAPF：色で目立つと緑の2つの平行マルピーギ管（図2Cに箱入りの領域を破線。）。
- 〜40 hAPF：マルピーギ管（図2Dの赤矢印）の前方端との間に位置するダークグリーンイエローボディ。
- 〜50 hAPF：マルピーギ管（図の枠で囲ま地域2Eと2E ''で拡大）と眼の中間点に位置するイエローボディは色で黄色になっている場合、白色遺伝子（赤の目の色のために必要）のための野生型。目の色は白突然変異表現型が統合されたレポーター遺伝子ベクター（図2E"）の一部であるミニ白遺伝子によって救出されたときに、この段階で不足している。
- 〜80 hAPF：ウィングのヒント灰色、腹部（図2Gに箱入りの地域と2Gの拡大"）の中間点に前方の間に位置するマルピーギ管、腹部tergites上腹部のセグメントと毛の間に折り目が（図2G表示されていると2G"）;と救出目の色は明るい赤（図2G"）です。
- 〜90 hAPF：翼は黒に暗く、（矢印）胸と毛腹部は（図2H）成熟と暗くなります;マルピーギ管と黄色のボディはtergitesの日焼けによって不明瞭と緑色の胎便は、腹部の背側後部先端部に表示されます（図2H ''）。
注意事項：
- アラカルトで変態のTEステージ、標本の性別は生殖器の形態（図2Iと2Jの矢印）や男性の脚の最初のセットで暗く性別櫛の存在によって決定することができる。
- ステージングのさらなる精度は、以前は17を説明するように追加の形態学的マーカーを考慮することによって達成することができます。
D.は蛹殻から試料を削除する手順：
- ラボのテープを使用すると、上向きに粘着面を解剖ボードにガムテープの一部を付着する。
- ペイントブラシを濡らし、pupariated標本に水分を適用する。ペイントブラシを使用して、キムワイプに試料を移す。
- 鉗子や絵筆を使って、梱包用テープに試料を移すと（蛹殻の湾曲した側）を上に向け背面に付着する。
- 標本が〜15分間乾燥することができます。乾燥した蛹殻が湿った時よりも開放する方がはるかに簡単です。この時点で、検体は粗く形態で上演することができます蛹殻を通して見えるマーカー。
- 鉗子を使用して、徐々に前蓋で蛹殻の始まりを開き、後端に向かって進んでください。より微細なスケールの解剖は、特定の組織を分離するために必要な場合はこのをPBS溶液で時計皿で行うことができます。そうでない場合は、顕微鏡スライド上に粘性HC700ハロカーボンのオイル（Sigma - Aldrich社）のドロップに蛹を転送する。
- 実体顕微鏡を使用して、スライド上の標本を位置づける、そして上記の基準（セクション2a）を用いて試料の段階を決定することができます..
3。全体のマウントのサンプルにおけるレポーター遺伝子の発現の共焦点顕微鏡検査
- 全体のマウント標本の場合、4Xまたは10Xの目標のいずれかを使用してください。水銀ランプの曝露によって刺激される蛍光を使用して、あるいは明るいフィールドに表示することによって、その後にフォーカスを標本をもたらす光学分野での位置の試料を顕微鏡のステージを調整する。
- 共焦点microscoの使い方PEソフトウェアは、EGFP（または他の蛍光タンパク質を使用して、適切な波長）のための励起波長を調整する。
- 標本を退色防止するために、5〜10％のレーザー強度で始まります。信号が、がっかりされている場合は、必要に応じて強度を増加させる。
- 共焦点画像の信号対雑音比を改善するために、複製のスキャンからの平均ピクセル測定そのソフトウェアの設定を有効にし、カルマンの平均またはラインとスタックの平均など。我々の経験では、3つのスキャンのためのカルマンフィルタの平均は長すぎる画像の収集のために時間を加えることなく、信号対雑音比を向上させます。
- CREの活動の定量的な比較のためには、試料の蛍光強度は、多くのピクセルを飽和していないことが不可欠である。いくつかのピクセルが飽和されるように蛍光が最も強い表示されるZ -セクションを使用して、設定を調整します。これは、飽和、警告のルックアップテーブルに切り替え、チャンネルの電圧、ゲインを調整することにより行われ、オフセットすることができますいくつかのピクセルが飽和している設定に。最後に、試料から十分な信号を収集するために、それは多くの場合、共焦点絞りを調整する必要があります。
- 最適な設定が決定されると、Z -スキャンを実行します。
- スキャンが完了すると、投影に画像のスタックを変換し、タグ付きイメージファイル形式または"TIFF"でこのイメージを保存する。
注：
- それは、CREの活動の定量的な比較に含まれるすべての複製標本とレポーター遺伝子の線に同じ焦点設定を使用することが不可欠です。
4。シス調節要素の活動を定量化
いくつかの共焦点買収のソフトウェアは、投影画像の更なる処理を可能にする一方で、我々は18共焦点画像を評価するために自由に利用できる画像Jのソフトウェアプログラムを使用することを好む。イメージを使用すると、J 18、記録されたGFPの発現パターン指定された領域内のピクセル値の統計情報として定量することができる。画像はグレースケールに存在する必要はありませんが私はそうすることを好む。
- 画像Jのプログラムが起動して、評価されるTIFFイメージを開きます。
- フリーハンドの選択]ボタンをクリックして、定量が望まれている試料の面積を概説し、例えば破線黄色の枠内で、図3の地域。 （定量化するために領域の選択に関する下記の注を参照してください。）
- 画素値の統計を取得するには、分析タブをクリックして、メジャーを選択します。結果ボックスには、地域、および平均値、最小値および最大ピクセル値のスコアを示す表示されます。平均ピクセル値のスコアを記録し、複製標本のための画素値の統計情報を生成するために繰り返す（複製数に関する注記Bを参照）。
- 例えば、赤い破線の境界線内に図3の領域を、我々は、CREがアクティブでないときにコントロールの領域から第2の平均ピクセル値を収集することをお勧めします。この後者のヴァルUEは、補正平均ピクセル値を取得する測定から、バックグラウンドの影響を除去するために以前の値から減算することができます。我々の経験ではこれがさらに複製標本（制御領域のサイズの選択に関する注記Cを参照）との間のばらつきを低減。
- CREと平均値の標準誤差の平均調節活性を計算するために複製標本からの補正平均ピクセル値を使用してください。この規制に関する活動の値と誤差の測定は、CREの順序が異なる他のレポータートランスジーン（例の図3）と比較することができます。
注意事項：
- 画像Jは、平均ピクセル値のスコアが決定されるから定義された図形と領域を選択するようにユーザーが可能になります。標本のサイズが頻繁に変化するにつれしかし、我々は、各試料ごとに評価される領域を指定するには、フリーハンドの選択ツールを使用することを好む。
- 複製の大きい数（N）の平均レギュレータのより良い推定結果与えられたCRE用latory活動。我々は、4と8の間にNが一般的に十分であることがわかります。
- 我々の経験では、選択したコントロールの領域のサイズが少し制御領域の測定の平均ピクセル値には影響を与えません。一般的に、我々は関心領域のサイズに比例する領域を選択します。
5。代表的な結果：
D.の野生型のバージョンキイロ CRE、二形性素子13と呼ばれるが、メス蛹（図3A）のA6腹部セグメントにおけるEGFPレポーター発現の高いレベルをドライブします。この要素内の13塩基対の配列は、DSXの転写因子の結合部位であることが判明した、とこのシーケンスのin vivoで重要性がこの結合部位が変異しているときにこのCREのための調節活性を定量することにより実証することができます。 100と野生型二形性要素の調節活性を考慮して± 5％、このDSXサイトの突然変異は、regを削減28〜ulatory活動± 3％。同様の比較は、種内のCRE対立遺伝子のためのまたは別の種からのオーソロガスCRES間の規制活動を行うことができます。例えば、D.によって駆動される女性のセグメントのA6のEGFPのレベルを考慮し100の規制活動としてキイロカントンS株の± 4％、種のためのオルソロガスCRES D. simulansとD. willistoniはそれぞれ75と同等の規制活動± 4％、0 ± 0％（図3B）持っていることが判明した。
図1トランスジェニック系統をホモ接合にするホワイト救助の目の表現型の強度を使用する。定量的レポータートランスジーンを評価するためには、各標本が同じレポーター遺伝子の遺伝子型を持つことが重要です。 （A）attPの着陸地点の配列を有する白色の遺伝子変異の遺伝的背景は、サイトのために利用されている pecificトランスジーンの組み込み。統合されたベクトルのホモ接合体（B）ヘミ接合および（C）トランスジェニック個体は典型的に統合されたミニ白遺伝子のコピー数によって救助の目の色の表現型の強さによって区別することができます。ホモ接合体の線が濃い目の色の表現型と（C）オスとメスのハエを交配することによって確立することができます。
図2。 ショウジョウバエのための変成ステージを決定する形態学的マーカーを使用する。幼生から成体ショウジョウバエの変態中に、性別とおおよその開発段階を決定するために使用できるステレオタイプ的な形態は、一連の試料の遷移。 BHの標本は、それらの蛹殻から削除されています。パネル、E、F、GとHのボックスは、"パネルにそれぞれの地域で拡大表示"、E"、F"、G"、およびHを示している。
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図3。 シス調節要素の活動の定量的比較。全てのサンプルについて、特定の二形性要素によって媒介EGFP -レポーター遺伝子の発現は蛹殻の形成後80時間の雌で評価した。各画像の上部にある数字は、A6腹部セグメントの平均ピクセル値（破線黄色の枠内の領域として左上ほとんどの画像に示される）を引いた平均値として算出される試料のためのEGFP発現のレベルです。 A4セグメントのピクセル値（バックグラウンド補正、赤い破線の境界線内の領域として左上ほとんどのイメージのために示されている）。各レポーターのために導入遺伝子の4つは、平均セグメントのA6のピクセル値を計算するために評価された複製。調節活性は、（）野生型の％または（B）カントンS株の女性は、ピクセル値の平均± SEMとして報告されます。の野生型対立遺伝子を持つ女性のための（A）GFPの発現二形性要素とDSXの転写因子に対して単一の結合部位がアブレーションされた変異体バージョン。この変異体結合部位は、28に二形性要素の活性を低下さ±野生型配列の3％。 D.へのオルソログ配列に対する規制活動の（B）の比較キイロ （カントンS株）二形性要素。 D.により媒介されるGFPの発現を検討100％、近縁種からのオルソログ配列のようなキイロ二形要素の対立遺伝子D. simulansとD. willistoniは、それぞれ75の活動± 4％、0 ± 0％を所有している。
6。材料
| 材料名 | タイプ | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| サイト固有のトランスジーンの組み込み | のサービス | 最高の遺伝子 | プランH | 着陸地点を選択し、形質転換体のラインを受信する |
| ハロカーボンのオイル | 試薬 | シグマアルドリッチ | H8898 | 共焦点イメージングのための標本をマウントするために使用 |
| デュモン＃5鉗子 | ツール | ファイン科学ツール | 11252〜40 | 解剖用の尖ったファインと耐久性 |
| SZ61ズームステレオ顕微鏡 | ツール | オリンポス | カスタマイズ可能 | ミバエ類を操作するための優れた光学 |
| FluoView共焦点顕微鏡 | ツール | オリンポス | カスタマイズ可能 | 高解像度の共焦点画像を提供します。 |
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Discussion
シス調節エレメントは、遺伝子発現パターンと、それによって開発1のプロセスを指定するゲノムプログラムをエンコード、および形態学的進化2-4および人間の特徴を5,6,19のための表現型変異の基礎となる両方の突然変異のための目立つ場所です。この重要性にもかかわらず、CRESの規制ロジックがよく分かっていないままです。このような理解の赤字のための顕著な理由は、定量的にCRESの機能配列を比較するために適当な方法の欠如となっています。ここでは、 キイロショウジョウバエは、CRESの研究に定量的なアスペクトを追加するための改良されたトランスジェネシスの手法を生かしたプロトコルを提示する。
複製は、（1）同じ発達段階のと（2）レポーター遺伝子がされる場合、弊社の経験ではCREの調節活性を定量するとき、複製標本間のばらつきが補正平均ピクセル値の10％以下である同じゲノム着陸地点インチ変化のこの量は、図3に示すCRESについて決定されたものと一致しており、CREの遺伝的に異なるバージョンが10％以上の値によって調節活性の異なる状況にこの定量的な方法の使用に制限を置きます。重要なことはしかし、この制限は、それらの勉強CRESは、以前に様々な活動を記述するときに使用しなければならなかったこと、"縮小"または"増加"の定性的な記述を大幅に改善です。
CREのバージョンが知られているか定量的にそれらの規制活動において異なることが発見されると、このプロトコルは、担当しているまたは活動の違い12,13に寄与する変異の差異の特定は可能です。これらの機能的に関連する変異を同定する能力は、そのようなtranscriの損益として分子メカニズムを、決定するために必要な最初のステップです。CREの活動が異なることが原因とption因子結合部位、。楽しみにして、他のショウジョウバエの CRESと他のモデル生物のためのプロトコルで同じような方法でのアプリケーションのためのこのプロトコルの使用が出現するCREのロジックを理解しやすくするために許可する必要があります。これは機能的に中立的な突然変異の泥沼から機能的に関連のCREの変異を識別する機能が含まれています。
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Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
我々は感謝：ニコラスGompelとこのプロトコルの発展への貢献に対してベンジャミンPrud'homme、メリッサウィリアムズと原稿についてのコメントの4つの匿名の査読、WARへの研究フェローシップのためのデイトン大学院大学、およびデイトン生物学の大学をTMWのための研究支援のための部門と研究所（UDRI）。この作品は、米国心臓協会グラントTMWに11BGIA7280000によってサポートされていました。
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