Summary
Fenotypische variatie voor de kenmerken kan het gevolg zijn van mutaties in cis-regulerende element (CRE) sequenties die de controle genexpressie patronen. Methoden afgeleid voor gebruik in Drosophila melanogaster kan kwantitatief vergelijken met het niveau van de ruimtelijke en temporele patronen van genexpressie gemedieerd door gewijzigde of natuurlijk voorkomende CRE varianten.
Abstract
Genexpressie patronen worden gespecificeerd door cis-regulerende element (CRE) sequenties, die ook worden genoemd enhancers of cis-regulatorische modules. Een typische CRE beschikt over een regeling van bindingsplaatsen voor diverse transcriptiefactor eiwitten die een regulerende logica te geven wanneer, waar en op welk niveau het gereguleerde gen (s) wordt uitgedrukt verlenen. De volledige set Cres in een dier genoom codeert voor het organisme-programma voor ontwikkeling van een, en empirische als theoretische studies tonen aan dat mutaties in Cres een prominente rol gespeeld in morfologische evolutie 2-4. Bovendien, het menselijk genoom wide association studies wijzen erop dat genetische variatie in Cres wezenlijke bijdrage leveren aan fenotypische variatie 5,6. Zo, het begrijpen van de regelgeving logica en hoe mutaties invloed hebben op een dergelijke logica is een centrale doelstelling van de genetica.
Reporter transgenen bieden een krachtige methode om de studie van de in vivo functieTIE Cres. Hier een bekende of vermoede CRE sequentie wordt gekoppeld aan heterologe promoter en coderende sequenties voor een reporter gen dat codeert voor een gemakkelijk waarneembare eiwit product. Toen een journalist transgen wordt ingebracht in een gastheerorganisme, de CRE de activiteit wordt zichtbaar in de vorm van de gecodeerde reporter eiwit. P-element gemedieerde transgenese in de fruitvlieg Drosophila soorten (D.) melanogaster 7 is gebruikt voor de komende decennia reporter transgenen te introduceren in dit model organisme, hoewel de genomische plaatsing van transgenen is willekeurig. Daarom is het reportergen-activiteit sterk beïnvloed door de lokale chromatine en gen-omgeving, het beperken van CRE vergelijkingen met zijn kwalitatief. In de afgelopen jaren, was de phiC31 gebaseerde integratie-systeem aangepast voor gebruik in D. melanogaster om transgenen in te voegen in specifieke genoom landingsplaatsen 8-10. Deze mogelijkheid heeft de kwantitatieve meting van gen-en, hier van belang, CRE-activiteit 11 tot 13 feasible. De productie van transgene fruitvliegjes kan worden uitbesteed, zoals phiC31-gebaseerde integratie, waardoor de noodzaak om dure apparatuur kopen en / of vaardigheden bij gespecialiseerde transgen injectie protocollen.
Hier presenteren we een algemeen protocol om kwantitatief te evalueren een CRE activiteit, en laten zien hoe deze aanpak kan worden gebruikt om de effecten van een mutatie geïntroduceerd op de activiteit een CRE's te meten en de activiteiten van de orthologe CRES vergelijken. Hoewel de gegeven voorbeelden zijn voor een CRE actief tijdens de fruitvlieg metamorfose, kan de aanpak worden toegepast op andere ontwikkelingsstadia, fruitvlieg soorten, of model organismen. Uiteindelijk moet een meer wijdverbreide gebruik van deze aanpak om te studeren CRES vooraf een goed begrip van de regelgeving logica en hoe logica kan variëren en evolueren.
Protocol
Overzicht:
Deze video toont een protocol dat in staat kwantitatief meten van het gen regelgevende werkzaamheden voor de cis-regulerende element (CRE) sequenties in Drosophila (D.) melanogaster. Dit protocol kan gebruikt worden om de regelgeving in het bezit van vergelijken: wild type en mutante vormen CRE, de natuur voorkomende CRE allelen binnen een soort, of orthologe CRES tussen uiteen soorten.
1. Site-specifieke integratie van de reporter transgenen in het genoom van Drosophila melanogaster
A. Reporter transgene bouw
- Als eerste stap, elke CRE geëvalueerd moeten afzonderlijk worden gekloneerd in een vector die een verslaggever (1) attB bacteriële aanhechting plaats die wordt gebruikt voor site-specific transgen integratie 8-11, (2) meerdere kloneringsplaats stroomopwaarts van een (3) bevat heterologe promoter, dat is door de (4) coderende sequentie gevolgd voor een fluorescerendeeiwit (zoals EGFP of DsRed).
- Hoewel elke vector kan worden compatibel gemaakt voor phiC31 gemedieerde site-specifieke integratie door de invoering van een attB sequentie in de vector backbone, de vector pS3aG12-14 kan worden verkregen bij de addgene plasmide repository (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG is een aangepaste versie van de P-gebaseerde transformatie vector15 waarbij een van de twee zigeuner isolatoren werd vervangen door een SfIb isolator, het bevat een uitgebreide multiple cloning site, en beschikt over een 250 basepaar sequentie die een attB attachment site. CRES van belang zijn ingebracht in de meervoudige kloneringsplaats stroomopwaarts van een Hsp70 minimale promotor en het EGFP-gen dat een verbeterde versie van groen fluorescent eiwit dat lokaliseert de kern codeert.
B. Site-specifieke integratie van de reporter transgenen
- Voor een reeks van Cres waarvan de activiteiten zijn te vergelijkend als een deel van verslaggever transgene vectoren, worden de gemaakte vectoren afzonderlijk geïntegreerd in dezelfde genomische landingsplaats. Hier is de phiC31 faag integrase eiwit katalyseert de unidirectionele recombinatie tussen de bacteriële (attB) attachment site in het transgen vector en een genomically gelegen faag (attP) attachment plaats 9. Verschillende groepen 8-11 hebben een verscheidenheid van transgene lijnen die een attP site (de zogenaamde landing sites) op te nemen en bevatten een genomische bron 8 van phiC31 dat dit eiwit tot uitdrukking in de geslachtscellen. Deze fly voorraden kunnen gemakkelijk verkregen worden uit de Bloomington Drosophila voorraad centrum (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- Een gepubliceerde protocol bestaat waarin het maken van transgene Drosophila site-specifiek gebruik phiC31 integrase 16. De apparatuur en technische expertise om transgene Drosophila li makennes is niet meer nodig als verschillende leveranciers bestaan (tabel 1) voor wie deze dienst kan worden uitbesteed.
- Transgen gedrag kan sterk variëren van het ene weefsel naar de volgende 11. Zo kan een enkele attP landing site is niet optimaal voor de analyse van alle Cres, ontwikkelingsstadia, en / of weefsels van de studie. Het is raadzaam om de activiteit van een CRE van belang te beoordelen in verschillende landen sites om een site waar de CRE activiteit is representatief voor de endogene target-gen (s) expressie patroon te vinden.
- Voor de verkregen transgene lijnen is het raadzaam om ze homozygoot zijn voor het transgen. CRE-activiteit is over het algemeen robuuster bij mensen met twee kopieën van het transgen en voor kwantitatieve metingen is het noodzakelijk dat vergelijkingen worden gemaakt tussen personen met hetzelfde aantal van de transgene exemplaren. Homozygote individuen kunnen worden verkregen door het gebruik van de balancer chromosomen. Voor goed gekarakteriseerd landingsplaatsen echter, is het vaak simpler om maagdelijke mannen en vrouwen verzamelen, en steek die met de meer intense oogkleur fenotype verleend door de mini-witte gen (fig. 1), zoals de witte mutant te redden die door de geïntegreerde transgen vector is meer dramatisch bij personen met twee vector exemplaren.
2. Het verkrijgen van monsters of weefsels van de juiste ontwikkelingsstadium
Verkrijgen van monsters voor analyse op het moment in ontwikkeling toen de genexpressie patroon (s) van belang optreden (s) endogeen, dus het tijdstip waarop de CRE in onderzoek moet reporter-gen expressie activeren. Voor de Drosophila, kan dit zowel embryonale, larven, pupal of volwassen stadia. Hieronder beschrijven we een methode om volwassen en metamorfe vliegt het podium, de laatste van die plaatsvindt binnen de puparium, een harde larvale huid die de immobiele monster bevat tot het ecloses als een volwassene.
- Uit te breiden transgene lijnen te specim zorgenens van de juiste stage zijn beschikbaar wanneer klaar voor reporter-gen expressie analyse van confocale microscopie. Stel twee flacons elk met verschillende (~ 5 - 10) mannelijke en vrouwelijke vliegen. Op wisselstroom dag, bump de vliegen van een van de flacons om een ongebruikte flacon. Herhaal dit voor een week. Tegen het einde van twee weken, zal transgene fruitvliegjes beschikbaar die variëren van larven tot volwassen ontwikkelingsstadia.
- Staging volwassen vliegen: De duur van de tijd doorgebracht in een puparium is 98 uur voor vrouwen en 102 uur voor mannen als gekweekt bij 25 ° C. Volwassen vliegen kan gemakkelijk worden verzameld wanneer zij uit de puparium (de zogenaamde Eclosion). Dit tijdpunt kan worden beschouwd als 0 uur na Eclosion. Volwassen vliegen kan worden gehouden tot het gewenste meetpunt voor analyse. Bijvoorbeeld, een CRE genaamd mel-oe1 dat de controles expressie van het gen in desatF de volwassen oenocytes van D. melanogaster vrouwen is niet actief direct na Eclosion maar CRE activiteit switches op na een dag 14. Als de juiste fase is verkregen, verdoven vliegen en situeren in een druppel Halocarbon olie op een dia en ga verder met confocale evaluatie.
- Staging exemplaren tijdens de metamorfose: Aan het einde van de derde-instar larvenstadium van de puparium wordt gevormd. Hoewel in dit stadium van het dier technisch gezien nog steeds een derde instar larve, deze ontwikkelingsfase is gemakkelijk herkenbaar als de als model is niet-mobiel, de puparium is zacht en wit, en de siphonen hebben eversie (Fig. 2A). Dit tijdpunt kan worden beschouwd als 0 uur Na Puparium Vorming (hAPF). In dit stadium kunnen mannetjes worden onderscheiden van de vrouwtjes door de aanwezigheid van bilateraal gelegen gonaden in de buurt van het middelpunt van het lichaam, die worden weergegeven als cirkels doorzichtig (verpakt in Fig. 2A en aangegeven met zwarte pijl in 2A ").
1. Staging gebaseerd op de lengte van de metamorfose:
Bij 0 hAPF, kunnen exemplaren worden overgedragen aan een nieuwe flaconof een petrischaal met een vochtige kwast. Om te voorkomen dat exemplaren uit uitdrogen, voeg dan een stukje Kimwipe en bevochtig met water. Overdracht flacon of schotel naar een 25 ° C incubator tot de gewenste hAPF.
2. Staging door zichtbare morfologische kenmerken:
Het is vaak lastig om monsters voor CRE activiteit op een bepaald tijdstip bepaald te analyseren naar aanleiding van de collectie van 0 hAPF exemplaren. Als alternatief kan men bepalen welke goed georganiseerd exemplaren op een tijdstip voor de analyse gebaseerd op de aanwezigheid en de positie van een aantal morfologische merkers (hieronder), die zichtbaar zijn via de puparium of na puparium verwijderen (afb. 2).
2a. Morfologische criteria voor de onderlinge aanpassing metamorfe graad:
- 0 hAPF: Witte prepupa stadium waarin de larve stopt met bewegen; anterior siphonen eversie (pijl in figuur 2A.); Laterale luchtpijp zichtbaar; zachte witte puparium (Fig. 2A).
- ~ 14 hAPF:Puparium gelooid en verhard; hoofd weg buiten gedraaid, laterale luchtpijp en de geslachtsklieren minder duidelijk, poten en vleugels volledig gestrekt langs de buik; Malpighian tubuli nog niet prominent en groen (gestreepte doos regio in figuur 2B.); Ogen ongepigmenteerde (Fig. 2B) .
- ~ 25 hAPF: Twee parallel Malpighian tubuli prominent en groen van kleur (gestreepte doos regio in figuur 2C)..
- ~ 40 hAPF: Donker groen geel lichaam bevindt tussen de voorste uiteinden van de Malpighian buisjes (rode pijlpunt in figuur 2D.).
- ~ 50 hAPF: Gele lichaam bevindt in het midden-punt van de Malpighian buisjes (. Boxed regio in figuur 2E en uitgebreid in 2E'') en de ogen zijn oranje van kleur als wild type voor wit gen (nodig voor rode oogkleur) . Oogkleur ontbreekt in deze fase als het witte mutant fenotype wordt gered door de mini-witte gen dat deel uitmaakt van de geïntegreerde reporter transgen vector (fig. 2E).
- ~ 80 hAPF: Wing tips grijs; Malpighian tubuli gelegen tussen voorste tot het midden van de buik (. Boxed regio in figuur 2G en uitgebreid in 2G "); plooien tussen buik-segmenten en borstels op de buik tergieten zichtbaar zijn (Fig. 2G en 2G "), en redde kleur van de ogen is helder rood (fig. 2G).
- ~ 90 hAPF: Wings donker tot zwart; Malpighian tubuli en geel lichaam verduisterd door looien van tergieten, thoracale (pijl) en abdominale borstelharen zijn volwassen en verduisterd (fig. 2H), en groen meconium verschijnt aan de dorsale achterste punt van de buik ( Fig. 2H'').
Opmerkingen:
- In late stadia van de metamorfose, kan het geslacht van de monsters worden bepaald door genitale morfologie (pijlpunten in Fig. 2I en 2J), of de aanwezigheid van donkere sex kammen op de eerste reeks van mannelijke benen.
- Verdere precisering bij het organiseren van kan worden bereikt door het bepalen van extra morfologische markers zoals eerder 17 beschreven.
D. Stappen voor het monster te verwijderen uit puparium:
- Met behulp van lab tape zich een stukje tape om een dissectie bord met de kleverige ondergrond naar boven.
- Wet een kwast en breng vocht pupariated exemplaren. Met behulp van een kwast, transfer exemplaren aan een Kimwipe.
- Met behulp van een tang of een kwast, transfer exemplaren aan de verpakkingstape en zich met de dorsale oppervlak naar boven (gebogen kant van de puparium).
- Laat exemplaren drogen ~ 15 minuten. Droge puparium zijn veel gemakkelijker te openen dan die zijn vochtig. Op dit punt exemplaren kan grof worden opgevoerd door de morfologischemarkers zichtbaar door de puparium.
- Met behulp van een tang, geleidelijk openstellen van de puparium te beginnen bij de voorste operculum en ga naar de achterkant einde. Indien een meer gedetailleerde dissectie is nodig om een specifiek weefsel te isoleren dit kan worden gedaan in een horlogeglas met PBS-oplossing. Anders, overdracht poppen tot een daling van de viskeuze HC700 Halocarbon olie (Sigma-Aldrich) op een microscoopglaasje.
- Situeren exemplaren op een dia, met behulp van een stereomicroscoop, en het gebruik van de hierboven beschreven criteria (paragraaf 2 bis) een exemplaar van de stage kan worden vastgesteld ..
3. Confocale microscopische evaluatie van de reporter-gen expressie in een hele berg monster
- Voor de hele montage exemplaren, gebruikt u de 4X-10X of doelstellingen. Met behulp van fluorescentie gestimuleerd door blootstelling aan kwik lamp, of als alternatief door het bekijken in heldere gebied, past u de microscoop podium positie model in het optische gebied dan specimen in beeld te brengen.
- Met behulp van de confocale microscope software, past u de excitatie golflengte voor EGFP (of een geschikte golflengte bij het gebruik van een ander fluorescerend eiwit).
- Om te voorkomen dat photobleaching een exemplaar, beginnen met een laser intensiteit van 5-10%. Als het signaal wordt underwhelming, dan verhogen de intensiteit als dat nodig is.
- Om het signaal te verbeteren ruis verhouding voor confocale beelden, in staat stellen software-instellingen dat de gemiddelde pixel metingen uit te repliceren scans, zoals Kalman middeling of lijn en stapelen gemiddeld. In onze ervaring Kalman gemiddeld voor drie scans verbetert de signaal-ruisverhouding, zonder het maken van de tijd voor het imago van inzameling te lang.
- Voor kwantitatieve vergelijking van de CRE-activiteit is het essentieel dat de fluorescentie-intensiteit voor een monster niet veel pixels verzadigd. Met behulp van een z-sectie waar fluorescentie lijkt het meest intense, instellingen aan te passen zodat de weinig pixels zijn verzadigd. Dit kan gedaan worden door over te schakelen naar een verzadiging-waarschuwing opzoektabel en het aanpassen van het kanaal spanning, gain en offsetom de instellingen waar weinig pixels zijn verzadigd. Ten slotte, om te verzamelen voldoende signaal uit een monster is het vaak nodig om de confocale diafragma aan te passen.
- Zodra de optimale instellingen worden bepaald, lopen de z-scan.
- Als de scan is voltooid zet de afbeelding stapel in een projectie en sla dit beeld in de Tagged Image File Format of "TIFF".
Opmerking:
- Het is essentieel om dezelfde confocale instellingen te gebruiken voor alle exemplaren kopiëren en verslaggever transgene lijnen die zullen worden opgenomen in een kwantitatieve vergelijking van de CRE-activiteiten.
4. Kwantificering van cis-regulerende element activiteit
Terwijl sommige confocale acquisitie software maakt het mogelijk voor de verdere verwerking van projectie beelden, geven wij de voorkeur van de vrij beschikbaar Afbeelding J-software programma te gebruiken om te evalueren confocale beelden 18. Met Image J 18 opgenomen GFP-expressie patronenkan worden gekwantificeerd als pixelwaarde statistieken binnen een bepaald gebied. Hoewel de beelden hoeven niet te worden in grijstinten geven wij de voorkeur om dat te doen.
- Met de Image J-programma gestart, opent u een TIFF-afbeeldingen worden geëvalueerd.
- Klik op de freehand selectie-knop en een overzicht van de oppervlakte van het monster waar de kwantificatie is gewenst, bijvoorbeeld de regio in figuur 3 binnen de gestippelde gele rand. (Zie noot hieronder een voor de selectie van een gebied te kwantificeren.)
- Om een pixelwaarde statistiek, klik op de Analyseren tabblad en selecteer vervolgens te meten. Een resultaten box zal verschijnen met daarin het gebied, en de gemiddelde, minimale en maximale pixelwaarde scores. Noteer de gemiddelde pixelwaarde score en herhaal tot pixelwaarde statistieken voor herhaling exemplaren te genereren (zie noot b met betrekking tot repliceren nummer).
- We raden aan het verzamelen van een seconde gemiddelde pixelwaarde van een controle regio waar de CRE is niet actief is, bijvoorbeeld de regio in figuur 3 binnen de gestippelde rode rand. Dit laatste value kan worden afgetrokken van de vorige waarde naar achtergrond-effecten te verwijderen uit de meting naar een gecorrigeerde gemiddelde pixelwaarde te krijgen. In onze ervaring dit verder vermindert variatie tussen repliceren exemplaren (zie noot c wat betreft omvang selectie voor controle regio).
- Gebruik maken van de aangepaste gemiddelde pixelwaarden van repliceren exemplaren van de gemiddelde regelgevende activiteit te berekenen voor een CRE en de standaard error van het gemiddelde. Deze regelgevende activiteit waarde en meting van de fout kan worden vergeleken met andere reporter transgenen, waar de CRE de volgorde verschilt (bijvoorbeeld figuur 3).
Opmerkingen:
- Afbeelding J staat voor de gebruiker te selecteren een gedefinieerde vorm en oppervlakte van waaruit een gemiddelde pixelwaarde score wordt bepaald. Echter, zoals grote exemplaren vaak varieert we de voorkeur aan de Freehand selectie tool te gebruiken om het gebied dat moet worden geëvalueerd voor elk specimen te geven.
- Een groter aantal herhalingen (N) resulteert in een betere inschatting van de gemiddelde verordeningregelgevende activiteit van een bepaald CRE. We vinden dat een N tussen 4 en 8 over het algemeen voldoende is.
- In onze ervaring van de grootte van het geselecteerde besturingselement gebied heeft weinig invloed op de gemeten gemiddelde pixelwaarde voor de controle regio. In het algemeen kiezen we een gebied evenredig is in grootte het gebied van belang.
5. Representatieve resultaten:
Een wild-type versie van een D. melanogaster CRE, genaamd de dimorfe Element 13, rijdt een hoog niveau van EGFP reporter tot uitdrukking in de A6 abdominale segment van vrouwelijke poppen (Fig. 3A). Een 13 basepaar volgorde binnen dit element bleek een bindingsplaats voor de DSX transcriptie factor, en de in vivo belang van deze sequentie kan worden aangetoond door het kwantificeren van de regelgevende activiteit voor deze CRE wanneer deze bindingsplaats is gemuteerd. Gelet op de regelgevende activiteit van het wilde type dimorfe Element om 100 ± 5%, mutatie van deze DSX website verlaagde de regulatory activiteit tot 28 ± 3%. Soortgelijke vergelijkingen kunnen worden gedaan van de regelgevende activiteiten voor intraspecifieke CRE allelen of tussen orthologe CRES van afzonderlijke soorten. Bijvoorbeeld, gezien het niveau van EGFP in vrouwelijke segment A6 gedreven door de D. melanogaster Canton S stam als een regelgevende activiteit van 100 ± 4%, orthologe CRES voor de soort D. simulans en D. willistoni bleken respectievelijk bezitten regelgevende werkzaamheden gelijk aan 75 ± 4% en 0 ± 0% (Fig. 3B).
Figuur 1. Met behulp van de intensiteit van het wit-rescue eye fenotype te maken transgene lijnen homozygoot. Om kwantitatief te evalueren reporter transgenen is het belangrijk dat elk monster dezelfde verslaggever transgen genotype hebben. (A) Een witte mutant gen genetische achtergrond met een attP landingsplaats volgorde wordt gebruikt voor site-s PECIFIEKE transgen integratie. Transgene individuen (B) hemizygoot en (C) homozygoot voor de geïntegreerde vector kan doorgaans worden onderscheiden door de intensiteit van de geredde oogkleur fenotype door het aantal exemplaren van de geïntegreerde mini-witte gen. Homozygote lijnen kunnen worden vastgesteld door kruising (C) mannelijke en vrouwelijke vliegt met de donkerste kleur van de ogen fenotype.
Figuur 2. Met behulp van morfologische markeringen op de metamorfe podium te bepalen voor Drosophila. Tijdens de metamorfose van een larve tot een volwassen fruitvlieg, het monster overgangen door een reeks stereotiepe morfologieën die kunnen worden gebruikt om de seks en benadering voor de ontwikkeling stadium vast te stellen. Exemplaren in BH zijn verwijderd uit hun puparium. Dozen in panelen A, E, F, G en H geven de ingezoomde in de regio's, respectievelijk voor panelen A ", E", F ", G", en H ".
"Figuur 3" src = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" />
Figuur 3. Kwantitatieve vergelijking van de cis-regulerende element activiteiten. Voor alle monsters EGFP-reporter gen-expressie gemedieerd door een bepaalde dimorfe Element werd beoordeeld bij vrouwtjes bij 80 uur na puparium vorming. Het nummer op de top van elk beeld is het EGFP-expressie niveau van het specimen dat wordt berekend als de gemiddelde pixel waarde voor de A6 abdominale segment (geïndiceerd voor de bovenste meest linkse imago van de regio binnen de gestippelde gele rand) minus het gemiddelde pixel waarde voor de A4-segment (achtergrond correctie, geïndiceerd voor de linker bovenhoek meest imago van de regio binnen de gestippelde rode rand). Voor elke reporter transgen vier herhalingen werden beoordeeld met een gemiddelde segment A6 pixel te berekenen. Regelgevende activiteit wordt gerapporteerd als het% van de (A) wild type of (B) Canton S stam vrouwelijke betekenen pixel waarde ± SEM. (A) GFP uitdrukking voor vrouwen het bezit van een wildtype allel van deDimorfe Element en een mutant versie waar een bindingsplaats voor de DSX transcriptiefactor was geablateerd. Deze mutant bindingsplaats verminderde dimorfe Element activiteit tot 28 ± 3% van de wild type sequentie. (B) Vergelijking van de regelgevende activiteiten voor sequenties orthologe aan de D. melanogaster (Canton S-stam) dimorfe Element. Gezien de GFP expressie gemedieerd door een D. melanogaster dimorfe Element allel als 100%, de orthologe sequenties uit de verwante soorten D. simulans en D. willistoni respectievelijk beschikken over de activiteiten van 75 ± 4% en 0 ± 0%.
6. Materialen
| Materiaal Naam | Type | Vennootschap | Catalogus nummer | Commentaar |
| Site-specifieke transgen integratie | Dienst | Beste Gene | Plan H | Kies een landingsplaats, krijgen transformant lijnen |
| Halogene Oil | Reagens | Sigma-Aldrich | H8898 | Wordt gebruikt om monsters voor confocale beeldvorming montage |
| Dumont # 5 Forceps | Gereedschap | Fine Science Tools | 11252-40 | Fijne puntige en duurzaam voor dissectie |
| SZ61 Zoom Stereo microscoop | Gereedschap | Olympus | Aanpasbare | Hoogwaardige lenzen voor het werken met fruitvliegen |
| FluoView confocale microscoop | Gereedschap | Olympus | Aanpasbare | Biedt een hoge-resolutie confocale beelden |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cis-regulatorische elementen coderen genomische programma dat de genexpressie patronen en daarmee het proces van ontwikkeling een specificeert, en zijn prominente locaties voor beide mutaties ten grondslag liggen aan morfologische evolutie 2-4 en fenotypische variatie voor menselijke trekjes 5,6,19. Ondanks dit belang, blijven de wettelijke logica voor Cres slecht begrepen. Een prominente reden voor dit inzicht tekort is het gebrek aan geschikte methoden om kwantitatief te vergelijken functionele sequenties van Cres. Hier presenteren wij een protocol dat speelt in op verbetering van transgenese methoden voor D. melanogaster als een kwantitatieve aspect toe te voegen aan de studie van Cres.
In onze ervaring bij het kwantificeren van regelgevende activiteit een CRE's, variatie tussen kopiëren exemplaren is van 10% of minder van de gecorrigeerde gemiddelde pixel waarde wanneer repliceert zijn (1) van dezelfde ontwikkelingsfase en (2) de verslaggever transgen isin dezelfde genomische landingsplaats. Deze hoeveelheid variatie is in overeenstemming met die bepaald voor de CRES weergegeven in figuur 3, en plaatst een beperking op het gebruik van deze kwantitatieve methode om situaties waarin genetisch verschillende versies van een CRE in regelgevende activiteit verschillen met een waarde groter dan 10%. Belangrijk is echter, deze beperking is een belangrijke verbetering ten opzichte van de kwalitatieve beschrijving van "verlaagd" of "verhoogd" dat die het bestuderen van CRES eerder had om te gebruiken bij het beschrijven van verschillende activiteiten.
Wanneer versies van een CRE is bekend of gevonden om kwantitatief te verschillen in hun regelgevende activiteiten, dit protocol maakt het mogelijk te bepalen welke van de mutatie-verschillen verantwoordelijk zijn voor of bijdragen aan de activiteit verschil 12,13. Het vermogen om deze functioneel-relevante mutaties te identificeren is een noodzakelijke eerste stap om de moleculaire mechanismen, zoals de winst of het verlies van transcri te bepalenkopen worden factor bindingsplaatsen, waardoor CRE activiteiten verschillen. In de toekomst moet het gebruik van dit protocol voor andere Drosophila Cres en de toepassing van vergelijkbare methoden in protocollen voor andere model organismen zorgen voor een beter begrip van de CRE logica naar voren. Dit omvat een mogelijkheid om functioneel relevante CRE mutaties te onderscheiden van het moeras van functioneel-neutrale mutaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken: Nicolas Gompel en Benjamin Prud'homme voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol, Melissa Williams en vier anonieme reviewers voor commentaar op het manuscript, de Universiteit van Dayton Graduate School voor onderzoek beurzen naar WAR, en de University of Dayton Biology afdeling en Research Institute (UDRI) voor ondersteuning van onderzoek voor TMW. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Grant 11BGIA7280000 aan TMW.
References
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
- Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
