Summary
וריאציה פנוטיפי עבור תכונות יכול לנבוע מוטציות cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט השליטה דפוסי ביטוי גנים. שיטות נגזר לשימוש תסיסנית melanogaster יכול כמותית להשוות את רמות דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בתיווך או שונה באופן טבעי וריאנטים cre.
Abstract
דפוסי ביטוי גנים שצוינו על ידי cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט, אשר נקראים גם משפרי או cis-הרגולציה מודולים. Cre טיפוסי בעל הסדר של אתרי קישור מספר גורם שעתוק חלבונים המקנים היגיון הרגולציה לציין מתי, היכן, ובאיזה רמה את הגן מוסדר (ים) באה לידי ביטוי. סט מלא של צרס בתוך הגנום מקודד חיה בתוכנית של האורגניזם 1 עבור פיתוח, אמפירי, כמו גם מחקרים תיאורטיים מצביעים על כך מוטציות צרס שיחק תפקיד מרכזי באבולוציה מורפולוגית 2-4. יתר על כן, הגנום האנושי מחקרים רחב העמותה עולה כי שונות גנטית ב צרס לתרום באופן משמעותי כדי וריאציה פנוטיפי 5,6. לפיכך, הבנה הגיון הרגולציה וכיצד מוטציות להשפיע על לוגיקה כזו היא המטרה המרכזית של הגנטיקה.
Transgenes כתב לספק שיטה רבת עוצמה כדי לחקור את in vivo function של צרס. הנה רצף ידועים או חשודים Cre היא מצמידים את האמרגן Heterologous רצפים הגן המקודד כתב קידוד המוצר חלבון נצפות בקלות. כאשר כתב transgene מוכנס לתוך הפונדקאי, הפעילות של Cre הופך לגלוי בצורה של החלבון המקודד הכתב. P-אלמנט transgenesis בתיווך של זבוב הפירות מינים תסיסנית (ד ') melanogaster 7 שימש במשך עשרות שנים כדי להציג transgenes כתב לתוך אורגניזם מודל זה, למרות המיקום הגנומי של transgenes היא אקראית. לפיכך, פעילות הגן כתב מושפעת במידה רבה על ידי הכרומטין המקומית סביבת הגן, להגביל השוואות Cre כדי להיות איכותי. בשנים האחרונות, המערכת phiC31 אינטגרציה מבוסס הותאם לשימוש ד melanogaster להכניס לתוך transgenes ספציפי הנחיתה 8-10 הגנום אתרים. יכולת זו הפכה את מדידה כמותית של גנים, רלוונטי כאן, cre 11-13 פעילות המוקדasible. הייצור של זבובי פירות מהונדס יכול להיות במיקור חוץ, כולל אינטגרציה phiC31 מבוססות, ומבטל את הצורך לרכוש ציוד יקר ו / או מיומנות מיוחדת פרוטוקולי transgene ההזרקה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כללית כמותית ולהעריך פעילות של cre, ולהראות כיצד גישה זו ניתן להשתמש כדי למדוד את ההשפעות של מוטציה הציג על פעילות של Cre ולהשוות את פעילותם של צרס orthologous. למרות הדוגמאות הן עבור פעיל Cre במהלך המטמורפוזה זבוב הפירות, הגישה יכול להיות מיושם על שלבי התפתחות אחרים, לטוס מינים פירות, או אורגניזמים מודל. בסופו של דבר, השימוש הנרחב יותר של גישה זו צרס המחקר צריך לקדם הבנה של הלוגיקה הרגולציה ואיך ההיגיון יכול להשתנות ולהתפתח.
Protocol
סקירה:
וידאו זה מדגים פרוטוקול המסוגל למדוד כמותית את פעילות הגן הרגולציה cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט melanogaster (ד ') תסיסנית. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להשוות את פעילות הרגולציה שבידי: סוג בר מוטציה צורות cre, טבעיים המתחוללים אללים Cre נמצא בתוך מין, או צרס orthologous בין מינים התפצלו.
1. אתר ספציפי האינטגרציה של transgenes כתב לתוך הגנום melanogaster תסיסנית
א transgene בנייה Reporter
- כצעד ראשון, cre כל הערכה חייבת להיות משובטים בנפרד לתוך וקטור כתב המכיל (1) attB מצורף חיידקי באתר רצף המשמש אתר ספציפי אינטגרציה transgene 11/08, (2) האתר שיבוט מרובים במעלה הזרם של (3) האמרגן Heterologous כי הוא ואחריו רצף (4) המקודד ניאוןחלבון (כגון EGFP או DsRed).
- בעוד וקטור כלשהו יכול להתבצע תואם עבור phiC31 אינטגרציה בתיווך אתר ספציפי על ידי החדרת רצף attB לתוך עמוד השדרה של וקטור, וקטור pS3aG12-14 ניתן לקבל ממאגר פלסמיד addgene (http://www.addgene.org/pgvec1) pS3aG היא גירסה מותאמת אישית של טרנספורמציה P מבוסס vector15 שבו אחד משני מבודדים צועני הוחלף מבודדת SfIb, הוא מכיל אתר משופר שיבוט מרובים, בעל 250 זוג בסיס רצף המכיל באתר המצורף attB. צרס עניין מוכנסים לתוך האתר שיבוט מרובים במעלה הזרם של האמרגן מינימלי hsp70 ואת הגן המקודד EGFP גרסה משופרת של חלבון פלואורסצנטי ירוק שמתאימה לגרעין.
ב אתר ספציפי האינטגרציה של transgenes כתב
- עבור קבוצה של צרס שפעילותם יש להשוותד כחלק וקטורים transgene הכתב, וקטורים שנוצר משולבים בנפרד לתוך באתר גנומי זהה הנחיתה. כאן phiC31 integrase חלבון phage מזרז את רקומבינציה חד כיווני בין האתר (attB) חיידקי מצורף וקטור transgene ו phage ממוקם genomically (attP) באתר המצורף 9. מספר קבוצות 8-11 הפכו את מגוון קווי מהונדס הכוללות אתר attP (מה שנקרא אתרי נחיתה) ומכילים מקור גנטי של 8 phiC31 המבטא את החלבון בתאי הנבט. אלו מניות לעוף ניתן להשיג בקלות מן תסיסנית Bloomington מניות במרכז (http://flystocks.bio.indiana.edu/) .
- פרוטוקול שפורסם קיים המפרט כיצד ליצור מהונדס תסיסנית אתר ספציפי באמצעות phiC31 integrase 16. הציוד מומחיות טכנית לעשות מהונדס תסיסנית liנס כבר לא נחוצה כמו מספר ספקים קיימים (טבלה 1) למי שירות זה ניתן במיקור חוץ.
- התנהגות transgene יכול להשתנות במידה רבה מן הרקמה אחד 11 הבא. לפיכך אתר נחיתה יחיד attP אינו אופטימלי לניתוח של כל צרס, שלבי ההתפתחות, ו / או רקמות של המחקר. רצוי להעריך את הפעילות של Cre עניין בכמה אתרי נחיתה שונים כדי למצוא אתר שבו הפעילות של Cre הוא נציג של גן המטרה אנדוגני (ים) דפוס הביטוי.
- עבור קווי מהונדס שהושגו רצוי להפוך אותם הומוזיגוטים transgene. פעילות Cre הוא בדרך כלל חזק יותר אצל אנשים עם שני עותקים של transgene ועבור מדידות כמותיות קיים הכרח כי השוואות נעשות בין אנשים עם אותו מספר עותקים transgene. אנשים הומוזיגוטים ניתן להשיג באמצעות איזון של כרומוזומים. עבור אתרי נחיתה מאופיין היטב כי, לעתים קרובות simpler לאסוף בתולה זכרים ונקבות, ולחצות אותם עם פנוטיפ יותר אינטנסיבי לצבע העין שמעניקה גן מיני לבנים (איור 1), כמו ההצלה מוטציה לבן מסופק על ידי וקטור transgene משולבת היא דרמטית יותר אצל אנשים עם וקטור two עותקים.
2. קבלת דגימות או רקמות של השלב ההתפתחותי המתאים
להשיג דגימות לניתוח בזמן בפיתוח כאשר ביטוי גנים דפוס (ים) של עניין להתרחש (ים) endogenously, ולכן הזמן שבו Cre תחת חקירה צריך להפעיל את הגן הביטוי העיתונאי. עבור תסיסנית, זה יכול להיות גם עובריים, הזחל, בשלבים גלמי או מבוגר. להלן נתאר שיטה לשלב זבובים בוגרים מותמרים; השנייה של המתקיים בתוך puparium, עור הזחל קשיח המכיל את הדגימה נייח עד ecloses כמבוגר.
- הרחבת קווי מהונדס כדי להבטיח specimENS השלב הנכון זמינים כאשר מוכן לנתח את ביטוי הגן הכתב על ידי מיקרוסקופיה confocal. להגדיר שני בקבוקונים שלכל אחד מהם (~ 5-10) כמה זבובים זכרים ונקבות. בימים לסירוגין, להקפיץ את עף מאחד צלוחיות כדי בקבוקון בשימוש. חזור על פעולה זו במשך שבוע. בסופו של שבועיים, זבובי פירות מהונדס יהיה זמין נע בין הזחל על שלבי ההתפתחות הבוגרת.
- Staging זבובים בוגרים: משך הזמן המושקע בתוך puparium הוא 98 שעות עבור 102 שעות נקבות לזכרים, כאשר גודלו של 25 ° C. זבובים למבוגרים ניתן לאסוף בקלות כשהם מתעוררים משנת puparium (הנקרא eclosion). Timepoint זה יכול להיחשב 0 שעות eclosion הודעה. זבובים בוגרים יכול להיות שגדלו עד timepoint הנדרש לניתוח. לדוגמה, נקרא Cre מל-oe1 השולט הביטוי של הגן desatF ב oenocytes הבוגרת ד melanogaster הנקבות אינו פעיל מיד לאחר eclosion אבל Cre פעילות switches אחרי יום אחד 14. כאשר השלב הנכון מתקבל, להרדים זבובים למקם בטיפת שמן Halocarbon בשקופית והמשך הערכה confocal.
- Staging דגימות במהלך המטמורפוזה: בסוף בשלב הזחל שלישי instar puparium נוצר. אמנם בשלב זה החיה מבחינה טכנית הוא עדיין זחל third instar, זה שלב התפתחותי הוא מזהה בקלות כמו הדגימה הוא לא נייד, puparium הוא רך ולבן, spiracles יש everted (איור 2A). Timepoint זה יכול להיחשב 0 שעות לאחר כינונה Puparium (hAPF). בשלב זה ניתן להבחין בין זכרים לנקבות על ידי נוכחות של בלוטות המין ממוקם בילטרלי ליד האמצע של הגוף שנראים כמו עיגולים שקופים (התאגרף באיור. 2A ו מסומנים בחץ שחור 2A ").
1. קביעת השלב מבוססת על אורך של מטמורפוזה:
ב 0 hAPF, דגימות ניתן להעביר בקבוקון טריצלחת פטרי או באמצעות מברשת צבע לח. כדי לשמור על דגימות מהתייבשות, להוסיף חתיכת Kimwipe ו ללחלח עם מים. העברת בקבוקון או צלחת ל 25 ° C החממה עד hAPF הרצוי.
2. על ידי קביעת תכונות מורפולוגיות גלוי:
לעיתים קרובות לא נוח לנתח דגימות לפעילות Cre ב timepoint מסוים בעקבות איסוף דגימות 0 hAPF. לחילופין, אפשר לזהות נכונה מבוים דגימות בזמן נוח לניתוח מבוסס על נוכחות ומיקום של סמנים מורפולוגיים שונים (כמפורט להלן) הנראים דרך puparium או לאחר הסרת puparium (איור 2).
2a. הקריטריונים מורפולוגי של קירוב בשלב מותמרים:
- 0 hAPF: לבן prepupa השלב שבו הזחל מפסיק לזוז; spiracles הקדמי everted (החץ 2A איור.); לרוחב קנה הנשימה גלוי, לבן ורך puparium (איור 2A).
- ~ 14 hAPF:Puparium שזוף מוקשה; ראש שק everted; קנה הנשימה לרוחב והאשכים ברורים פחות; רגליים וכנפיים המורחבת מלא לאורך הבטן; tubules Malpighian לא בולט עדיין ירוק (אזור התאגרף מקווקו באיור 2 ב.); עיניים חסרות צבע (איור 2 ב ') .
- ~ 25 hAPF: שני tubules Malpighian מקבילים בולטים בצבע ירוק (מקווקווים אזור התאגרף באיור 2C.).
- ~ 40 hAPF: Dark הגוף צהוב ירוק ממוקם בין הקצוות הקדמי של tubules Malpighian (חץ אדום באיור 2.).
- ~ 50 hAPF: גוף צהוב מיקומו בנקודת אמצע של tubules Malpighian (. האזור התאגרף באיור 2E והורחבה''2E) ואת העיניים בצבע ענבר אם סוג בר עבור גן לבן (הדרוש צבע עיניים אדומות) . צבע עיניים חסר בשלב זה כאשר פנוטיפ מוטנטי לבן הוא חולץ על ידי הגן מיני לבן כי הוא חלק הכתב משולב transgene וקטור (2E איור ').
- ~ 80 hAPF: טיפים אגף אפור tubules Malpighian הממוקם בין קדמית לאמצע הבטן (. האזור התאגרף באיור 2G והורחבה 2G "); קפלי בין מגזרים הבטן זיפים על הבטן tergites גלויים (איור 2G ו 2G "); וצבע עיניים הצילו הוא אדום בוהק (איור 2G").
- ~ 90 hAPF: כנפיים חשוך לשחור; tubules Malpighian גוף צהוב מוסתר על ידי שיזוף של tergites; החזי (חץ) ואת הבטן זיפים בשלים חשוך (איור 2H), וכן מקוניום ירוק מופיע בקצה האחורי הגבי של הבטן ( איור. 2H'').
הערות:
- בלהבשלבים te של מטמורפוזה, מין של דגימות ניתן לקבוע על ידי מורפולוגיה גניטלי (חצים באיור. 2i ו 2J) או קיומם של יחסי מין מסרקים חשוך על הסט הראשון של הרגליים הגברית.
- דיוק נוסף הזמני ניתן להשיג על ידי שיקול של סמנים מורפולוגיים נוספים כפי שתואר לעיל 17.
ד צעדים כדי להסיר דגימה מן puparium:
- באמצעות קלטת המעבדה לדבוק פיסת אריזה קלטת ללוח דיסקציה עם המשטח הדביק כלפי מעלה.
- רטוב מברשת צבע להחיל לחות דגימות pupariated. באמצעות מברשת צבע, להעביר דגימות כדי Kimwipe.
- באמצעות מלקחיים או, מכחול דגימות להעביר לקלטת אריזה דבקים עם המשטח הגבי פונה כלפי מעלה (הצד הקמור של puparium).
- אפשר דגימות להתייבש במשך ~ 15 דקות. Puparium יבש הרבה יותר קל לפתוח מאשר אלה לח. בשלב זה ניתן דגימות גס מבוים על ידי מורפולוגייםלעין דרך puparium סמנים.
- בעזרת מלקחיים, בהדרגה להיפתח בתחילת puparium ב operculum הקדמי ולהתקדם לקראת סוף האחורי. אם לנתיחה יותר משובח בקנה מידה יש צורך לבודד רקמה ספציפית זה יכול להיעשות זכוכית שעון עם פתרון PBS. אחרת, העברת גלמים ירידה של נפט צמיג HC700 Halocarbon (Sigma-Aldrich) בשקופית מיקרוסקופ.
- למקם דגימות בשקופית, באמצעות stereomicroscope, באמצעות הקריטריונים שתוארו לעיל (סעיף 2 א) בשלב של הדגימה ניתן לקבוע ..
3. הערכה מיקרוסקופית Confocal של ביטוי גנים כתב במדגם הר שלמה
- עבור כל דגימות הר, השתמש באחת המטרות 4X או 10X. באמצעות הקרינה מגורה על ידי חשיפה מנורת כספית, או לחילופין על ידי הצגת בתחום בהיר, להתאים את הבמה מיקרוסקופ כדי הדגימה משרה בתחום האופטי אז להביא דגימה אל המוקד.
- שימוש microsco confocalpe התוכנה, להתאים את אורך הגל עירור עבור EGFP (או אורך גל מתאים בעת שימוש אחר חלבון פלואורסצנטי).
- כדי למנוע photobleaching טיפוס, להתחיל לייזר בעוצמה של 5-10%. אם האות underwhelming, ואז להגביר את העוצמה לפי הצורך.
- כדי לשפר את יחס אות לרעש עבור תמונות confocal, לאפשר הגדרות תוכנה פיקסל המדידות הממוצע מסריקות לשכפל, כגון ממוצעים של קלמן או קו ממוצע של מחסנית. מניסיוננו בממוצע קלמן במשך שלוש סריקות משפר את יחס אות לרעש בלי הזמן אוסף תמונה יותר מדי זמן.
- עבור השוואות כמותיות של פעילות Cre זה הכרחי כי עוצמת הקרינה עבור דגימה לא רווי פיקסלים רבים. בעזרת Z-מופיע סעיף שבו הקרינה העזה ביותר, להתאים את ההגדרות כך כמה פיקסלים רוויים. ניתן לעשות זאת על ידי מעבר לשולחן הרוויה-אזהרה בדיקת והתאמת מתח הערוץ, רווח, ואת קיזוזבהגדרות שם כמה פיקסלים רוויים. לבסוף, על מנת לאסוף מספיק אות מן הדגימה היא לעתים קרובות צורך להתאים את הצמצם confocal.
- לאחר הגדרות אופטימליות נחושים, הפעל את Z-סריקה.
- לאחר השלמת הסריקה להמיר את התמונה לתוך ערימה הקרנת ושמור את התמונה בתבנית Tagged Image File או "TIFF".
הערה:
- זה חיוני כדי להשתמש בהגדרות confocal זהה עבור כל דגימות לשכפל transgene קווי כתב כי תיכלל השוואה כמותית של פעילויות cre.
4. כימות cis-הרגולציה פעילות אלמנט
בעוד כמה תוכנות הרכישה confocal מאפשר עיבוד נוסף של תמונות הקרנה, אנחנו מעדיפים להשתמש J זמין בחינם תמונה תוכנה להעריך תמונות confocal 18. באמצעות תמונה J 18 נרשם ביטוי של GFP דפוסיניתן לכמת כמו סטטיסטיקה ערך פיקסל בתוך אזור מסוים. למרות דימויים לא צריך להיות בקנה מידה אפור אנו מעדיפים לעשות זאת.
- עם תוכנית J תמונה התחיל, לפתוח תמונה TIFF כדי להיות מוערכים.
- לחץ על לחצן הבחירה ביד חופשית המתאר את השטח של הדגימה בהם quantitation הוא הרצוי, למשל באזור באיור 3 בתוך הגבול צהוב מקווקו. (ראה הערה למטה בנושא בחירת אזור כדי לכמת).
- כדי לקבל נתון ערך פיקסל, לחץ על הכרטיסייה ניתוח ולאחר מכן בחר למדוד. תיבת התוצאות יופיעו מראה את האזור, וערך עשרות כלומר, מינימום ומקסימום פיקסל. הקלט את ציון ממוצע ערך פיקסל וחזור כדי לייצר סטטיסטיקה ערך פיקסל עבור דגימות לשכפל (ראה ב הערה לגבי מספר לשכפל).
- אנו ממליצים על איסוף אומר second פיקסל ערך מאזור השליטה בו Cre אינו פעיל, למשל באזור באיור 3 בגבול אדום מקווקו. Val זה האחרוןUE יכול להיות מופחת ערך לשעבר להסיר השפעות הרקע המדידה כדי לקבל ערך מותאם פיקסל מתכוון. מניסיוננו זה מקטין עוד יותר וריאציה בין דגימות לשכפל (ראה ג הערה לגבי בחירת גודל לאזור שליטה).
- השתמש בערכים המותאמים פיקסל אומר מתוך דגימות לשכפל לחשב את פעילות הרגולציה הממוצע Cre ואת שגיאת התקן של הממוצע. ערך זה פעילות הרגולציה ומדידה של שגיאה ניתן להשוות transgenes עיתונאי אחר שבו רצף של Cre שונה (למשל עבור איור 3).
הערות:
- תמונה J מאפשר למשתמש לבחור צורה מוגדרת באזור שממנו ציון ממוצע ערך פיקסל ייקבע. עם זאת, כמו גודל הדגימה משתנה לעתים קרובות אנו מעדיפים להשתמש בכלי בחירה Freehand כדי לציין את האזור כדי להעריך עבור כל דגימה.
- מספר גדול יותר של משכפל (N) תוצאות אמידה טובה יותר של משמעות reguפעילות latory עבור Cre נתון. אנו מוצאים כי N בין 4 ל 8 הוא בדרך כלל מספיקים.
- מניסיוננו את גודל השטח הבקרה שנבחרו יש מעט השפעה על הערך הנמדד כלומר פיקסל לאזור שליטה. באופן כללי, אנו בוחרים שטח בגודל יחסי לאזור של עניין.
5. נציג תוצאות:
גרסה סוג הפראי של ד melanogaster cre, שנקרא אלמנט דימורפית 13, כוננים רמה גבוהה של ביטוי עיתונאי EGFP במגזר A6 הבטן של הנקבה גלמים (איור 3A). 13 זוג בסיס רצף בתוך רכיב זה נמצא להיות אתר מחייב גורם שעתוק DSX, ואת חשיבות vivo של רצף זה ניתן להדגים על ידי לכימות פעילות הפיקוח על זה Cre כאשר באתר זה מחייב הוא מוטציה. בהתחשב בפעילות התקינה של אלמנט דימורפית בר סוג להיות 100 ± 5%, מוטציה של אתר זה DSX הפחית את regפעילות ulatory עד 28 ± 3%. השוואה דומה ניתן לעשות פעילות הפיקוח על אללים intraspecific Cre או בין צרס orthologous ממינים שונים. לדוגמה, בהתחשב ברמות EGFP ב A6 קטע נקבה מונעת על ידי ד melanogaster קנטון S זן כפעילות הרגולציה של 100 ± 4%, צרס orthologous עבור המין ד simulans וד willistoni נמצאו בהתאמה בעלי פעילות הרגולציה שווה 75 ± 4% ו 0 ± 0% (איור 3B).
באיור 1. שימוש בעוצמת פנוטיפ הצלה לבן העין ליצור קווים מהונדס הומוזיגוטים. על מנת להעריך כמותית transgenes עיתונאי חשוב הדגימה לכל אחד מאיתנו יש גנוטיפ זהה transgene הכתב. (א) הגן המוטנטי לבן רקע גנטי עם רצף של אתר הנחיתה attP מנוצל עבור האתר-s pecific אינטגרציה transgene. אנשים הטרנסגניים (ב) hemizygous ו (ג) הומוזיגוטים וקטור משולב בדרך כלל יכול להיות מכובדת על ידי העוצמה של פנוטיפ הצילה עין צבע במספר עותקים של הגן מיני משולב לבן. קווי הומוזיגוטים ניתן הוקמה על ידי מעבר (C) זבובים זכרים ונקבות עם פנוטיפ האפלים צבע עיניים.
באיור 2. שימוש בסמנים מורפולוגיים, כדי לקבוע את השלב מותמרים עבור תסיסנית. במהלך המטמורפוזה של הזחל לטוס פרי בוגרים, המעברים הדגימה באמצעות סדרה של מורפולוגיות סטריאוטיפית, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את מין שלב הפיתוח המשוער. דוגמאות של BH הוסרו puparium שלהם. קופסאות של לוחות A, E, F, G ו-H לציין את zoomed באזורים בהתאמה לוחות "E", ו "G", ו-H ".
"איור 3" src = "/ files/ftp_upload/3395/3395fig3.jpg" />
באיור 3. השוואה כמותית של cis-הרגולציה פעילויות אלמנט. לקבלת דוגמיות כל EGFP-הכתב ביטוי גנים בתיווכו של אלמנט מסוים דימורפית הוערכה אצל נקבות ב 80 שעות לאחר היווצרות puparium. מספר בחלק העליון של כל תמונה היא רמת EGFP ביטוי עבור הדגימה המחושב כערך פיקסל מתכוון עבור קטע הבטן A6 (הצביעו עבור התמונה העליונה השמאלית ביותר של האזור בתוך הגבול צהוב מקווקו) בניכוי ממוצע פיקסל ערך עבור מגזר A4 (תיקון הרקע: הצביעו עבור התמונה העליונה השמאלית ביותר של האזור בתוך גבול אדום מקווקו). עבור כל כתב transgene four משכפל הוערכו לצורך חישוב פלח אומר A6 ערך פיקסל. פעילות תקינה היא כפי שדווח% של סוג (A) בטבע או (ב) זן S קנטון הנשי אומר ערך פיקסל ± SEM. (א) ה-GFP ביטוי אצל נקבות בעלי אלל סוג של בראלמנט דימורפית וגרסה מוטציה בו אתר קישור יחיד עבור גורם שעתוק DSX היה ablated. אתר זה מחייב מוטציה מופחת פעילות אלמנט דימורפית עד 28 ± 3% של רצף סוג בטבע. (ב) השוואה בין פעילות הפיקוח על רצפים orthologous את ד melanogaster (זן S קנטון) דימורפית אלמנט. בהתחשב ביטוי של GFP מתווך על ידי ד melanogaster אלל אלמנט דימורפית כמו 100%, את רצפי orthologous של מינים קרובים ד simulans וד willistoni בהתאמה בעלי פעילות 75 ± 4% ו - 0 0% ±.
6. חומרים
| חומר שם | סוג | חברה | מספר קטלוגי | הערה |
| אתר ספציפי transgene אינטגרציה | שרות | Best ג'ין | תוכנית H | בחירת אתר נחיתה, לקבל קווי transformant |
| Halocarbon שמן | מגיב | Sigma-Aldrich | H8898 | משמש הר דגימות עבור הדמיה confocal |
| דומון # 5 מלקחיים | כלי | המדע כלים פיין | 11252-40 | פיין ציין ועמיד לנתיחה |
| SZ61 סטריאו זום מיקרוסקופ | כלי | אולימפוס | להתאמה אישית | אופטיקה מצויינת לעבודה עם זבובי פירות |
| FluoView Confocal מיקרוסקופ | כלי | אולימפוס | להתאמה אישית | מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה confocal |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
cis-הרגולציה אלמנטים לקודד את התוכנית גנומית המציין דפוסי ביטוי גנים ועל ידי כך את תהליך הפיתוח 1, הם מקומות בולטים הן מוטציות הבסיסית באבולוציה מורפולוגית 2-4 ו וריאציה פנוטיפי עבור תכונות אנושיות 5,6,19. למרות חשיבות זו, ההיגיון הרגולציה צרס להישאר ממעטים להבין. סיבה בולטת של הגרעון הבנה זו כבר חוסר שיטות מתאים כמותית להשוות רצפי תפקודית של צרס. כאן אנו מציגים פרוטוקול מנצל שיטות transgenesis משופרת ד melanogaster כדי להוסיף היבט כמותי ללימוד צרס.
מניסיוננו כאשר לכימות פעילות הרגולציה של cre, וריאציה בין דגימות לשכפל היא של 10% או פחות של הערך הממוצע מותאם פיקסל משכפל כאשר הם (1) של השלב ההתפתחותי אותו (2) הוא כתב transgeneב באתר גנומי זהה הנחיתה. זו כמות וריאציה עולה בקנה אחד עם זה נקבע על צרס המוצג באיור 3, ומקומות מגבלה על השימוש בשיטה זו כמותית למצבים בהם גרסאות שונות גנטית של Cre שונים בפעילות הרגולציה לפי ערך גדול יותר מאשר 10%. חשוב לציין כי, מגבלה זו מהווה שיפור משמעותי לעומת התיאורים האיכותי של "מופחת" או "עלייה" כי מי צרס לומד בעבר להשתמש בתיאור פעילות משתנים.
כאשר גרסאות של Cre ידועים או נמצא כמותית שונים בפעילות הרגולציה שלהם, פרוטוקול זה הופך אפשרי בקביעת ההבדלים מוטציוני אחראים או לתרום ההבדל פעילות 12,13. היכולת לזהות אלו תפקודית הרלוונטיים מוטציות היא צעד ראשון הכרחי כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים, כגון הרווח או ההפסד של transcriגורם ption אתרי הקישור, גורמת פעילות Cre להיות שונה. במבט קדימה, השימוש בפרוטוקול זה עבור אחרים צרס תסיסנית ויישום של שיטות דומות פרוטוקולים עבור אורגניזמים מודל אחר צריך לאפשר הבנה טובה יותר של Cre הגיון לצאת. זה כולל יכולת להבחין מבחינה תפקודית הרלוונטיים מוטציות Cre מעל הביצה של תפקודית נייטרלי מוטציות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
אנו מודים: ניקולא Gompel ובנימין Prud'homme על תרומתם לפיתוח של פרוטוקול זה; מליסה וויליאמס וארבעה בודקים אנונימי הערות על כתב היד; של אוניברסיטת דייטון בוגר בית הספר עבור מלגות מחקר מלחמה; של אוניברסיטת דייטון ביולוגיה מחלקת מכון המחקר (UDRI) תמיכה מחקר TMW. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט 11BGIA7280000 כדי TMW.
References
- Davidson, E. H. The Regulatory Genome. Gene Regulatory Networks in Development and Evolution. , Academic Press. (2006).
- Wray, G. A. The evolutionary significance of cis-regulatory mutations. Nat. Rev. Genet. 8, 206-216 (2007).
- Stern, D. L. Evolutionary developmental biology and the problem of variation. Evolution. 54, 1079-1091 (2000).
- Carroll, S. B. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134, 25-36 (2008).
- Sethupathy, P., Collins, F. S. MicroRNA target site polymorphisms and human disease. Trends Genet. 24, 489-497 (2008).
- Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461, 199-205 (2009).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science. 218, 341-347 (1982).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 3312-3317 (2007).
- Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166, 1775-1782 (2004).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. , United States. (2008).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, 1663-1667 (2009).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, 610-623 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS biology. 7, e1000168-e1000168 (2009).
- Barolo, S., Carver, L. A., Posakony, J. W. GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. BioTechniques. 29, 726-732 (2000).
- Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phiC31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. , England. (2007).
- Drosophila: A laboratory handbook. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (2005).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. S., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Musunuru, K. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature. 466, 714-721 (2010).
